在规模化养殖中,由于抗生素疗法在临床应用中占主导地位,多重耐药菌株增殖和抗生素药物残留导致的食品安全问题日益突出。2020年7月1日起,国内饲料生产企业已全面停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商业饲料。在“减抗替抗”政策的驱动下,以益生菌为代表的微生态制剂的研发和使用成为疾病防控的新方向。
益生菌是一类对宿主健康有益的活性微生物。当益生菌在宿主肠道内定植后,会通过调节肠道菌群平衡、改善肠黏膜结构、增强肠道屏障功能、分泌抗菌物质及调节肠道pH来抑制病原菌生长繁殖,还能通过刺激机体免疫系统、分泌免疫蛋白等途径提高宿主免疫力[1-2]。目前,国内外常见的饲用益生菌主要包括乳酸菌、酵母菌及芽孢杆菌等[3]。其中,乳酸菌能通过代谢产生有机酸、抗菌肽和过氧化氢等活性物质,有效抑制病原菌繁殖,还能调节肠道菌群平衡、改善代谢功能,从而提升畜禽生长性能与机体免疫力[4-5]。贾荣玲等[6]研究发现,在断奶仔猪饲粮中添加0.2%乳酸菌可显著提高其平均日采食量和平均日增重,并显著降低腹泻率,从而有效改善生长性能。研究表明,源自动物肠道的乳酸菌对pH、温度和盐度具有广谱耐受性,同时还具备一定的耐药与抑菌能力,能更好地适应宿主生理环境,从而更有效地发挥其益生功能[7]。本研究拟从健康犊牛粪便及育肥牛各肠段黏液和内容物样品中分离鉴定乳酸菌,综合评价其生物学特性及安全性,以筛选出具有良好益生特性的乳酸菌菌株,为牛源饲用微生态制剂的研发提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品采集
本研究中动物试验相关程序已获宁夏农林科学院科技伦理委员会批准,批准编号为NKYCCSC-2025054。于宁夏某牛场和屠宰场分别无菌采集西门塔尔杂交犊牛粪便以及育肥牛不同肠段(十二指肠、空肠、回肠和盲肠)内容物和黏液样品,置于冰盒内冷藏保存备用。
1.1.2 主要试剂
MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基、营养肉汤培养基、MH琼脂培养基、2.5 L厌氧产气包和厌氧培养袋均购自青岛海博生物技术有限公司;革兰氏染色液购自上海源叶生物科技有限公司;脱纤维羊血购自北京索莱宝生物科技有限公司;药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司;碳酸钙(CaCO3)购自上海广诺化学科技有限公司;牛胆盐、胃蛋白酶和胰蛋白酶均购自天津恒基利得生物科技发展有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。
1.1.3 供试菌株及细胞系
牛源大肠杆菌K99分离株、肠道沙门氏菌ATCC 14028标准菌株和金黄色葡萄球菌ATCC 25923标准菌株由宁夏农林科学院动物科学研究所动物疫病研究室提供;牛肠上皮细胞(bovine intestinal epithelial cells,BIECs)由河南科技大学张才教授团队馈赠。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株分离纯化
分别取1 g犊牛粪便、育肥牛各肠段黏液及内容物样品,溶解于9 mL无菌生理盐水中,采用MRS肉汤培养基进行倍比稀释,分别选择10-5、10-6、10-7梯度下的稀释液均匀涂布在CaCO3-MRS琼脂培养基上,放于含2.5 L厌氧产气包的厌氧培养袋内,倒置于37 ℃培养箱中厌氧培养过夜。培养结束后观察菌落形态,挑选具有明显溶钙圈且菌落形态存在差异的单菌落进行分离纯化。将纯化3代以上的菌液与25%甘油按1∶1(V∶V)的比例混匀,于-80 ℃保存备用。每次试验前,需将菌株在MRS肉汤培养基中至少活化3次。
1.2.2 菌株形态学鉴定
将纯化后的菌株涂布于MRS琼脂培养基上,观察菌落形态。挑取单菌落进行革兰氏染色,观察并记录菌体形态。
1.2.3 菌株生化鉴定
分别挑取固体培养基上的单菌落,置于洁净载玻片上,滴加3%过氧化氢溶液数滴,观察结果。于30 s内产生气泡的为过氧化氢酶阳性菌株,反之为阴性菌株。试验设置3个重复,初步筛选过氧化氢酶阴性的菌株用于后续研究。
1.2.4 菌株溶血试验
将初筛的菌株于MRS肉汤培养基中厌氧培养24 h后,采用分区划线法将菌液接种于含5%脱纤维羊血的琼脂培养基上,于37 ℃厌氧培养24~48 h,观察是否出现溶血现象,筛选出不溶血的菌株。
1.2.5 菌株16S rRNA基因鉴定
将初筛纯化的菌种保存液充分活化后离心,收集菌体,根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取菌株的DNA。采用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')进行扩增。扩增程序为95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环;72 ℃终末延伸6 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后,回收目标PCR产物,送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司测序。将测序结果在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行BLAST序列比对以鉴定菌种。
1.2.6 耐受性试验
1.2.6.1 耐酸、耐胆盐试验
耐酸试验:取1 mL活化后的菌液,离心后用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次并重悬,以2%(V/V)的接种量分别接种于pH为3.0、4.0、7.0(对照)的MRS肉汤培养基中,37 ℃培养4 h后进行平板活菌计数,以log10(CFU/mL)表示菌体数量,计算菌株存活率。
耐胆盐试验:将活化后的菌液按2%(V/V)的接种量分别接种于不含胆盐(对照)以及含3 g/L(0.3%)胆盐的MRS肉汤培养基中,37 ℃培养4 h后进行平板活菌计数,以log10(CFU/mL)表示菌体数量,计算菌株存活率。
菌株存活率计算公式为:
存活率(%)=(试验组培养基活菌数/对照组培养基活菌数)×100。
1.2.6.2 人工胃肠液耐受性试验
参照文献[8]的方法配制人工胃肠液。人工胃液:用1 mol/L盐酸溶液将MRS肉汤培养基的pH调至3.0,加入胃蛋白酶溶液,使其终浓度为3 mg/mL,经0.22 μm滤膜过滤除菌备用。人工肠液:用0.1 mol/L氢氧化钠溶液将MRS肉汤培养基的pH调至8.0,加入胰蛋白酶溶液,使其终浓度为1 mg/mL,经0.22 μm滤膜过滤除菌备用。将活化后的菌液以2%(V/V)的接种量分别接种至人工胃液、人工肠液及MRS肉汤培养基(对照)中,37 ℃恒温培养4 h后进行平板活菌计数,计算菌株存活率(计算公式同1.2.6.1)。
1.2.7 抑菌试验
采用牛津杯法进行菌株抑菌试验。将筛选菌株接种于MRS肉汤培养基中培养24 h,调整菌液浓度至1×108 CFU/mL备用。于每个无菌培养皿中放置3个牛津杯,分别将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及肠道沙门氏菌3种指示菌在MH营养琼脂培养基未凝固(温度37~38 ℃)时调整菌液浓度至1×108 CFU/mL,充分混匀后倾倒于培养皿。待培养基凝固后取出牛津杯,每孔加入100 μL菌悬液,以无菌MRS肉汤培养基作为阴性对照。将培养皿置于37 ℃厌氧环境中培养24 h,每组设置3个重复。培养结束后,用游标卡尺测量各孔抑菌圈直径,并计算其平均值。
1.2.8 药物敏感性试验
采用纸片扩散法(K-B法)进行药物敏感性试验。将活化后的菌液浓度调整至1×108 CFU/mL,均匀涂布于MRS琼脂培养基上,待平板表面自然干燥后,无菌操作将药敏纸片均匀贴附于培养基表面,37 ℃厌氧培养24 h后,用游标卡尺测量抑菌圈直径,参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)标准判定菌株的药物敏感性。
1.2.9 黏附能力测定
1.2.9.1 表面疏水性测定
参考碳氢化合物细菌黏附法(BATH法)测定菌株表面疏水性。将活化后的菌液离心后,用无菌PBS洗涤菌体后重悬,调整菌悬液浓度为1×108 CFU/mL,测定菌悬液在600 nm波长处的吸光度(OD600 nm)值,记为A0 min。将3 mL菌悬液与1 mL二甲苯涡旋振荡混匀,在37 ℃下静置孵育30 min,小心吸取下层水相,测定OD600 nm值,记为A30 min。菌株表面疏水性计算公式为:
表面疏水性(%)=[1-(A30 min/A0 min)]×100。
1.2.9.2 自聚合能力测定
将活化后的菌液离心后用无菌PBS洗涤2次,重悬于4 mL无菌PBS中,测定OD600 nm值,记为A0。将菌悬液于37 ℃静置孵育2 h后,吸取上清液测定OD600 nm值,记为A2 h。自聚合能力计算公式为:
自聚合能力(%)=[1-(A2 h/A0)]×100。
1.2.9.3 牛肠上皮细胞黏附试验
将筛选菌株按2%(V/V)的接种量接种于MRS肉汤培养基中,37 ℃培养24 h,用DMEM培养基重悬并调整菌液浓度至1×108 CFU/mL备用。取生长至单层的牛肠上皮细胞,用无菌PBS洗涤2次,每孔加入1 mL菌悬液,以空白DMEM培养基为阴性对照,置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中孵育2 h,用无菌PBS洗涤细胞3次后,加入甲醇固定细胞30 min,经革兰氏染色后观察细菌对细胞的黏附情况,计算黏附指数。在光学显微镜油镜下随机选取10个视野,统计黏附于细胞表面的细菌数量,计算每个细胞的平均黏附菌数,即黏附指数。黏附能力判定标准:黏附指数≤1为不黏附或弱黏附;1<黏附指数<50为中等黏附;黏附指数≥50为强黏附[9]。
1.2.10 菌株生长曲线与产酸曲线测定
将纯化菌株按5%(V/V)的接种量接种于MRS液体培养基中厌氧培养。分别在培养0、2、4、8、12、16、24、36和48 h时测定菌液的OD600 nm值,同时测定相应时间点菌液的pH,以培养时间(h)为横轴,OD600 nm值和pH为纵轴,分别绘制菌株生长曲线和产酸曲线。
1.3 数据分析
试验数据使用SPSS 22.0软件进行分析,结果以平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 8.0.1软件绘图。
2 结果与分析
2.1 菌株的培养形态及生化鉴定结果
图1 部分菌株在CaCO3-MRS琼脂培养基上的菌落形态及溶钙圈Fig.1 Colony morphology and calcium-solubilizing zones of some strains on CaCO3-MRS agar medium |
2.2 菌株溶血试验结果
2.3 筛选菌株16S rRNA基因鉴定结果
图4 部分菌株16S rRNA PCR扩增电泳图M:DL2000 DNA分子量标准 DL2000 DNA marker;1~11:分离菌株PCR产物 PCR products of isolated strains;12:阴性对照 negative control。 Fig.4 Electrophoretogram of 16S rRNA PCR amplification of some strains |
表1 部分菌株16S rRNA基因序列比对结果Table 1 16S rRNA gene sequence alignment results of some strains |
| 菌株编号 Strain number | 菌种名称 Species name | 拉丁文名称 Latin name | 覆盖率 Coverage/% | 同源性 Homology/% | 序列号 Accession No. |
|---|---|---|---|---|---|
| LHQNY21 | 戊糖片球菌 | Pediococcus pentosus | 99.00 | 99.79 | MT604838.1 |
| LHQNY22 | 戊糖片球菌 | Pediococcus pentosus | 99.00 | 100.00 | OP420573.1 |
| JRFB41 | 戊糖片球菌 | Pediococcus pentosus | 99.00 | 99.79 | MT604838.1 |
| LHQNY30 | 唾液乳杆菌 | Lactobacillus salivarius | 99.00 | 99.93 | CP097165.1 |
| LHQNY62 | 唾液乳杆菌 | Lactobacillus salivarius | 99.00 | 99.72 | MT613616.1 |
| LHQNY71 | 敏捷乳杆菌 | Lactobacillus agilis | 99.00 | 99.86 | MN537457.1 |
| LHQNY73 | 敏捷乳杆菌 | Lactobacillus agilis | 99.00 | 99.65 | MT573827.1 |
| LHQNY82 | 发酵乳杆菌 | Lactobacillus fermentum | 99.00 | 99.66 | MT463429.1 |
| LHQNY84 | 唾液乳杆菌 | Lactobacillus salivarius | 99.00 | 99.65 | ON005140.1 |
| LHQNY87 | 罗伊氏乳杆菌 | Lactobacillus reuteri | 99.00 | 100.00 | CP015408.2 |
| WLNY9 | 干酪乳杆菌 | Lactobacillus casei | 98.00 | 98.00 | MG674667.1 |
| WLNY10 | 融合乳杆菌 | Lactobacillus confusa | 98.00 | 99.44 | MT613585.1 |
| LHQNY72 | 黏膜乳杆菌 | Lactobacillus mucosae | 98.00 | 100.00 | MT613556.1 |
| LHQNY66 | 植物乳杆菌 | Lactobacillus plantarum | 99.00 | 99.73 | MT538599.1 |
2.4 耐酸、耐胆盐试验结果
对分离的64株乳酸菌进行耐酸及耐胆盐性能评价,结果显示,所有菌株在pH 4.0条件下的存活率均高于80%,但在pH 3.0条件下培养4 h后耐受性都有所降低,其中19株存活率高于60%(表2)。
表2 乳酸菌在不同pH及胆盐条件下的生长情况Table 2 Growth of lactic acid bacteria under different pH and bile salt conditions % |
| 菌株编号 Strain number | 存活率Survival rate | ||
|---|---|---|---|
| pH=4.0 | pH=3.0 | 0.3%胆盐 0.3% bile salt | |
| LHQNY21 | 91.92 | 72.23 | 69.84 |
| LHQNY22 | 90.21 | 69.16 | 66.87 |
| LHQNY26 | 90.48 | 81.03 | 81.05 |
| LHQNY29 | 87.33 | 76.41 | 73.69 |
| LHQNY30 | 88.71 | 81.24 | 73.49 |
| JRFB33 | 88.55 | 62.24 | 61.75 |
| JRFB34 | 92.20 | 80.72 | 81.95 |
| JRFB40 | 84.98 | 81.53 | 76.77 |
| JRFB41 | 87.84 | 73.25 | 69.89 |
| ZWFB45 | 91.46 | 70.06 | 75.04 |
| LHQNY57 | 92.16 | 83.11 | 83.75 |
| LHQNY60 | 90.60 | 82.34 | 84.84 |
| LHQNY62 | 93.36 | 83.88 | 85.53 |
| LHQNY71 | 90.94 | 78.98 | 82.28 |
| LHQNY80 | 89.82 | 80.98 | 83.58 |
| LHQNY82 | 92.11 | 87.31 | 87.11 |
| LHQNY84 | 89.98 | 77.17 | 79.81 |
| LHQNY87 | 90.48 | 78.63 | 83.02 |
| LHQNY88 | 90.26 | 73.05 | 71.35 |
19株耐酸菌株在含0.3%胆盐的培养基中存活率为61.75%~87.11%;其中2株唾液乳杆菌(LHQNY60、LHQNY62)与1株发酵乳杆菌(LHQNY82)的存活率高于84%,而所有戊糖片球菌在0.3%胆盐条件下的耐受性能均较差。
2.5 人工胃肠液耐受性试验结果
对19株耐酸及耐胆盐性能较好的乳酸菌菌株开展人工胃肠液耐受性试验,结果(图5)显示,其中11株菌株在人工胃液条件下的存活率高于70%,包含2株戊糖片球菌(JRFB41、ZWFB45)、2株敏捷乳杆菌(LHQNY26、LHQNY71)、5株唾液乳杆菌(JRFB34、LHQNY57、LHQNY60、LHQNY62、LHQNY80)、1株罗伊氏乳杆菌(LHQNY87)和1株发酵乳杆菌(LHQNY82)。这11株乳酸菌在人工肠液中培养4 h后也表现出优良的耐受性,除戊糖片球菌(JRFB41、ZWFB45)外,其余菌株的存活率均超过100%。
2.6 抑菌试验结果
表3 乳酸菌对致病菌的抑菌圈直径Table 3 Diameter of inhibition zone of lactic acid bacteria against pathogenic bacteria mm |
| 菌株编号 Strain number | 抑菌圈直径Diameter of inhibition zone | ||
|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 Escherichia coli | 沙门氏菌 Salmonella | 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus | |
| LHQNY26 | 12.67±0.29(+) | 14.20±0.26(++) | 16.20±0.26(++) |
| JRFB34 | 12.83±0.29(+) | 14.33±0.29(++) | 13.63±0.32(+) |
| JRFB41 | 13.50±0.00(+) | 14.17±0.29(++) | 16.33±0.29(++) |
| ZWFB45 | 14.23±0.25(++) | 13.37±0.32(+) | 15.27±0.25(++) |
| LHQNY57 | 14.23±0.25(++) | 13.93±0.51(+) | 17.23±0.25(+++) |
| LHQNY60 | 14.42±0.14(++) | 13.50±0.50(+) | 16.33±0.29(++) |
| LHQNY62 | 14.53±0.06(++) | 17.67±0.29(+++) | 19.50±0.50(+++) |
| LHQNY71 | 14.17±0.29(++) | 17.17±0.29(+++) | 21.90±4.94(+++) |
| LHQNY80 | 13.17±0.29(+) | 16.53±0.06(++) | 19.90±0.36(+++) |
| LHQNY82 | 14.53±0.06(++) | 14.67±0.29(++) | 17.10±0.69(+++) |
| LHQNY87 | 13.23±0.25(+) | 14.77±0.21(++) | 17.17±0.29(+++) |
+:抑制 inhibition;++:中度抑制 moderate inhibition;+++:强抑制 strong inhibition。 |
图6 部分乳酸菌对3种致病菌的抑菌效果图A以大肠杆菌为指示菌,1~4分别为ZWFB45、LHQNY57、LHQNY82和对照菌株;图B以沙门氏菌为指示菌,1~4分别为JRFB34、LHQNY62、LHQNY80和对照菌株;图C以金黄色葡萄球菌为指示菌,1~4分别为LHQNY80、LHQNY71、LHQNY62和对照菌株。 Fig.6 Antibacterial effects of some lactic acid bacteria against three pathogenic bacteria Figure A used Escherichia coli as the indicator bacterium, with plates 1 to 4 representing ZWFB45, LHQNY57, LHQNY82 and control strains, respectively; figure B used Salmonella as the indicator bacterium, with plates 1 to 4 representing JRFB34, LHQNY62, LHQNY80 and control strains, respectively; figure C used Staphylococcus aureus as the indicator bacterium, with plates 1 to 4 representing LHQNY80, LHQNY71, LHQNY62 and control strains, respectively. |
2.7 药物敏感性试验结果
表4 乳酸菌的药物敏感性试验结果Table 4 Drug sensitivity test results of lactic acid bacteria |
| 项目 Items | 菌株编号Strain number | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| LHQNY26 | JRFB34 | JRFB41 | ZWFB45 | LHQNY57 | LHQNY60 | LHQNY62 | LHQNY71 | LHQNY80 | LHQNY82 | LHQNY87 | ||
| 链霉素Streptomycin | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | 14.00±0.10 (I) | 20.10±0.10 (S) | |
| 卡那霉素Kanamycin | - (R) | 11.97±0.15 (R) | - (R) | 15.27±0.25 (I) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | 13.77±0.25 (I) | 16.13±0.12 (I) | |
| 氨苄西林Ampicillin | 19.27±0.21 (S) | 27.33±0.13 (S) | 33.33±0.76 (S) | 29.00±0.50 (S) | 35.20±0.26 (S) | 40.10±0.36 (S) | 32.07±0.12 (S) | 30.40±0.26 (S) | 36.20±0.26 (S) | 36.40±0.26 (S) | 34.10±0.10 (S) | |
| 环丙沙星Ciprofloxacin | 21.70±0.26 (S) | 30.87±0.10 (S) | 30.00±0.15 (S) | - (R) | 26.27±0.05 (S) | 26.30±0.26 (S) | 22.50±0.10 (S) | 24.27±0.25 (S) | 25.20±0.20 (S) | 16.33±0.15 (I) | 15.20±0.20 (R) | |
| 氧氟沙星Ofloxacin | 24.97±0.45 (S) | 26.30±0.26 (S) | 28.27±0.25 (S) | 15.10±0.16 (I) | 27.80±0.20 (S) | 25.30±0.44 (S) | - (R) | 22.50±0.10 (S) | 25.73±0.25 (S) | 18.67±0.15 (S) | 14.17±0.15 (I) | |
| 诺氟沙星Norfloxacin | - (R) | 18.37±0.32 (S) | 26.13±0.12 (S) | - (R) | 19.20±0.06 (S) | - (R) | 16.00±0.20 (I) | 16.30±0.20 (I) | 20.30±0.20 (S) | - (R) | - (R) | |
| 多西环素Doxycycline | 36.97±0.45 (S) | 27.30±0.26 (S) | 35.63±0.32 (S) | 26.40±0.36 (S) | 40.57±0.21 (S) | 34.17±0.15 (S) | 16.63±0.15 (I) | 14.20±0.26 (I) | 30.93±0.12 (S) | 32.00±0.10 (S) | 26.10±0.10 (S) | |
| 四环素Tetracycline | 36.23±0.25 (S) | 21.70±0.16 (S) | 40.50±0.50 (S) | 27.23±0.25 (S) | 37.33±0.29 (S) | 41.23±0.25 (S) | 13.20±0.10 (R) | 15.90±0.17 (I) | 35.17±0.40 (S) | 30.17±0.15 (S) | 26.10±0.10 (S) | |
| 红霉素Erythromycin | 32.33±0.29 (S) | 24.47±0.07 (S) | 40.90±0.36 (S) | 34.20±0.42 (S) | 33.47±0.15 (S) | 34.17±0.29 (S) | 30.37±0.15 (S) | 30.77±0.25 (S) | 33.20±0.26 (S) | 34.10±0.10 (S) | 34.10±0.10 (S) | |
| 多黏菌素B Polymyxin B | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | 10.17±0.15 (I) | |
| 万古霉素Vancomycin | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | - (R) | 10.30±0.10 (R) | |
| 头孢唑林Cefazolin | 35.80±0.26 (S) | 26.30±0.20 (S) | 29.67±0.29 (S) | 26.67±0.42 (S) | 35.43±0.21 (S) | 37.5±0.15 (S) | 38.03±0.15 (S) | 36.97±0.15 (S) | 35.37±0.25 (S) | 35.63±0.15 (S) | 30.20±0.10 (S) | |
| 头孢氨苄Cephalexin | 26.40±0.36 (S) | 23.37±0.32 (S) | 35.70±0.44 (S) | 17.10±0.36 (I) | 30.33±0.21 (S) | 18.70±0.26 (I) | 27.00±0.20 (S) | 26.50±0.10 (S) | 26.30±0.26 (S) | - (R) | 36.17±0.15 (S) | |
| 头孢拉定Cefradine | 30.00±0.50 (S) | 23.70±0.26 (S) | 35.10±0.26 (S) | 18.30±0.26 (S) | 36.23±0.25 (S) | 31.77±0.25 (S) | 32.53±0.06 (S) | 30.27±0.25 (S) | 30.6±0.17 (S) | - (R) | 35.83±0.15 (S) | |
| 氟苯尼考Florfenicol | 19.23±0.25 (S) | 19.45±0.07 (S) | 32.27±0.25 (S) | 30.73±0.25 (S) | 29.90±0.53 (S) | 31.37±0.22 (S) | 35.20±0.20 (S) | 36.20±0.26 (S) | 36.30±0.10 (S) | 30.20±0.10 (S) | 31.20±0.20 (S) | |
S:敏感 sensitive;I:中度敏感 moderately sensitive;R:耐药 resistance;-:无抑菌圈 no inhibition zone。 |
图7 部分乳酸菌的药物敏感性图A、图B和图C分别为LHQNY80、LHQNY82和LHQNY87菌株的药物敏感性试验结果。药敏纸片a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n和o分别代表抗生素多西环素、卡那霉素、多黏菌素B、链霉素、氨苄西林、红霉素、四环素、头孢氨苄、氧氟沙星、头孢唑林、诺氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考、头孢拉定和万古霉素。 Fig.7 Drug sensitivity of some lactic acid bacteria Figures A, B and C showed the drug sensitivity test results of LHQNY80, LHQNY82 and LHQNY87 strains, respectively. Antibiotic sensitivity discs a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n and o represented the antibiotics doxycycline, kanamycin, polymyxin B, streptomycin, ampicillin, erythromycin, tetracycline, cephalexin, ofloxacin, cefazolin, norfloxacin, ciprofloxacin, florfenicol, cefradine and vancomycin, respectively. |
2.8 黏附能力测定结果
2.8.1 表面疏水性
如图8-A所示,11株乳酸菌的表面疏水性为8.30%~42.44%,其中LHQNY62菌株的表面疏水性最高,为42.44%,LHQNY82菌株次之,为41.42%,LHQNY80菌株的表面疏水性最低,为8.30%。
2.8.2 自聚合能力
如图8-B所示,11株乳酸菌表现出不同程度的自聚合能力(13.11%~67.21%),LHQNY82菌株的自聚合能力最强,为67.21%,LHQNY62菌株次之,为53.18%,LHQNY87菌株的自聚合能力最弱,为13.11%。
2.8.3 对牛肠上皮细胞的黏附效果
选取自聚合能力较好的LHQNY62与LHQNY82菌株进行牛肠上皮细胞黏附试验,镜检结果如图9所示。LHQNY62和LHQNY82菌株的黏附指数分别为20.44和19.42,均介于1~50,表明2株菌均具备中等黏附能力。
2.9 生长曲线与产酸曲线测定结果
3 讨论
3.1 菌株的耐受性分析
益生菌进入胃肠道后,会受到胃部酸性环境和肠道胆盐环境的双重挑战,导致细胞膜结构破坏、DNA活性受损,进而影响其生长繁殖[10]。因此,益生菌若要在肠道内定植并有效发挥益生作用,必须具备对低pH和高胆盐的耐受能力,这也是益生菌筛选的重要标准之一[11-12]。在正常生理状态下,胃液的pH约为3.0,小肠内的胆盐浓度处于0.03%~0.30%[13]。乳酸菌能够借助胆盐水解酶、应激蛋白以及自身细胞膜的保护作用,防止高浓度胆盐破坏细胞膜的正常结构[14]。刘燕红等[15]从牦牛犊牛粪便中分离的12株乳酸菌中,有7株在pH 4.0条件下的存活率在70%以上;在0.3%胆盐条件下,存活率在45%以上的有8株。江宇航[16]筛选得到的唾液乳杆菌L.S.05在模拟胃液和肠液中的存活率分别为57.76%和95.11%,在0.3%胆盐条件下的存活率为62.64%。在本研究筛选出的64株乳酸菌中,有19株在pH 3.0条件下培养4 h后存活率仍大于60%,且在0.3%胆盐条件下的存活率为61.75%~87.11%。对这19株乳酸菌进行人工胃肠液耐受性试验后发现,其中11株菌的存活率大于70%,而从肠段黏液中分离的唾液乳杆菌LHQNY62和发酵乳杆菌LHQNY82表现出更优的耐受性。能够生活在黏膜层的菌株,需要面对来自宿主消化液的挑战,因此它们需具备更稳健的应激反应系统来应对肠道内的各种压力。这提示本研究筛选出的唾液乳杆菌LHQNY62和发酵乳杆菌LHQNY82在正常胃肠道环境中具备良好的存活能力,具有潜在的益生应用价值。
3.2 菌株的抑菌性分析
3.3 菌株的耐药性分析
益生菌既可能携带耐药基因导致病原体耐药性提高[22],也可利用其自身耐药特性或与抗生素协同来降低抗生素相关性腹泻[23],并有望通过竞争性抑制耐药菌来对抗耐药问题[24],关键在于对菌株选择、耐药机制及使用场景的精准把控。因此,对候选益生菌菌株进行药物敏感性检测,是评估其能否作为饲料添加剂在生产中安全使用的重要环节[25]。廖义潇等[26]分离的牛源发酵乳杆菌对万古霉素具有耐药性。本研究对筛选出的11株乳酸菌进行了15种抗生素的药物敏感性试验,结果显示所有菌株均对万古霉素具有耐药性,与前述研究结果一致。而乳酸杆菌对万古霉素的耐药性属于内在耐药,且与染色体紧密关联,因此其耐药基因向其他属或种细菌发生水平转移的风险相对较低[27]。此外,本试验筛选出的11株乳酸菌对头孢唑林、氟苯尼考、氨苄西林及红霉素均表现出敏感性,在生产中应避免与这些抗生素联合使用。
3.4 菌株的黏附性分析
菌株对胃肠道上皮细胞的黏附能力是其能否在机体内定植并发挥益生作用的基础[28-29]。表面疏水性与自聚合能力有助于乳酸菌在肠道内定植,且疏水性越强的细菌,通常在水中的聚集性越高,也更容易与宿主细胞表面发生黏附[30]。乳酸菌的自聚合能力不仅有助于其在肠道内实现黏附与定植,还能帮助机体抵抗病原菌的入侵[31]。江宇航[16]分离的唾液乳杆菌L.S.05的自聚性和表面疏水性分别为61.16%和57.12%。廖义潇等[26]分离的发酵乳杆菌对Caco-2细胞的黏附数量为43.3 CFU/个,表明其对肠道细胞的黏附能力较好。本研究中筛选出的11株乳酸菌中唾液乳杆菌LHQNY62的表面疏水性最高,为42.44%,发酵乳杆菌LHQNY82的自聚合能力最强,为67.21%。进一步利用牛肠上皮细胞建立体外模型,对上述2株表面特性较优的菌株进行黏附能力评价,发现唾液乳杆菌LHQNY62和发酵乳杆菌LHQNY82对牛肠上皮细胞的黏附能力均属于中等水平,该特性或与其分离自肠段黏液相关。肠道黏膜菌株为在肠腔蠕动环境中实现定植,通常具备黏附肠道黏膜的天然能力,这意味着它们被摄入后,在肠壁上定植的可能性更高,从而有助于其在肠道微生态中快速定植与增殖,建立稳定和平衡的微生物群,形成抵御致病菌的重要屏障。
3.5 菌株的生长特性分析
乳酸菌的生长性能与产酸性能是评价其益生潜力的重要指标之一[32]。通过碳水化合物发酵产生乳酸是乳酸菌的主要代谢特征[33]。研究发现,将乳酸菌添加到饲粮中可有效降低饲粮pH,有助于形成厌氧环境,抑制病原微生物活性,从而阻碍其生长繁殖[34]。本研究中,唾液乳杆菌LHQNY62和发酵乳杆菌LHQNY82均在接种2 h后快速增殖并进入对数生长期,培养12 h后进入稳定期,该生长趋势与魏振[21]的研究结果一致。在产酸性能方面,2株菌接种2 h后菌液pH均迅速下降,其中发酵乳杆菌LHQNY82菌液的pH下降速度相对缓慢,最低不低于4.0;而唾液乳杆菌LHQNY62菌液的pH可降至约3.5,表现出更强的产酸能力。耐酸与产酸性能试验结果证实,这2株乳酸菌不仅具备在酸性环境下存活生长的能力,还能大量合成有机酸;而其优异的产酸能力可进一步降低肠道pH,从而对致病菌形成强效抑制作用。上述特性表明,唾液乳杆菌LHQNY62和发酵乳杆菌LHQNY82具备作为肠道健康保护剂的潜在应用价值。
4 结论
本研究从健康犊牛粪便及育肥牛各肠段黏液和内容物样品中分离出100株乳酸菌候选菌株,经过系统筛选,最终获得1株唾液乳杆菌LHQNY62和1株发酵乳杆菌LHQNY82。这2株菌均表现出无溶血活性,并具有较好的耐酸、耐胆盐特性。与同源菌株相比,其在抑菌和黏附性能方面表现更为突出,具备良好的益生潜力,可作为饲用益生菌制剂的优质候选菌株,有望在牛养殖生产中用于促进肠道健康、减少抗生素使用。