20世纪50年代,研究者发现在细菌非磷酸化糖分解的初级氧化阶段中,所涉及的酶并不依赖于烟酰胺类辅酶——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)[NAD(P)]的作用,而且这些酶的活性可以通过引入某种未知的化合物得到调节[1]。随后在甲醇脱氢酶中证实这种化合物是一种含有2个氮和3个羧基的邻醌——吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)[2]。PQQ是一种天然醌酸化合物,分子式为C14H6N2O8,相对分子质量为330.21,广泛存在于植物、某些细菌以及动物组织中[3]。作为一种芳香族三环O-醌类化合物,PQQ最初在甲烷营养细菌中被鉴定为是一种氧化还原酶的辅酶,随后在多种原核生物的脱氢酶中发现其作为氧化还原的辅因子,被认为可能是第14种维生素,但是否将其归类为维生素还需要进一步考察[4-5]。研究表明,PQQ在抗氧化应激、抗炎、促进线粒体生成、维护动物健康及提高生产性能方面具有重要潜力[6]。其中,三水合吡咯喹啉醌二钠(PQQNa2·3H2O)作为PQQ的钠盐,因其具有良好的水溶性和稳定性,是膳食补充剂的潜在候选物质,可能在健康补充品领域得到应用[4]。本文主要围绕PQQ的结构和性质、来源和生物合成、生物学功能及其作为功能性饲料添加剂在动物生产中的应用进行综述,旨在为PQQ在动物生产领域的应用提供参考。
1 PQQ的结构和性质
图1展示了PQQ的化学结构式,它的分子结构中包含3个羧基和1个吡咯环;PQQ具有良好的水溶性和生物兼容性,这使其能够在生物体内以离子形式存在,可以有效地被细胞吸收并参与代谢过程[7]。同时,PQQ作为一个杂环芳香族化合物,包含3种形态:完全氧化的醌(PQQ)、半还原的半醌自由基(PQQ·或PQQH·)和完全还原的喹醇(PQQH2),这意味着它可以通过在不同形态间的转化来实现电子的转移[8]。PQQ的三环结构使其在空间上具有特定的构型,由于其环状结构的共轭体系和芳香性,具有较高的热稳定性和化学稳定性[9],这使其能在动物体内较稳定的发挥作用。酶的活性位点与底物结合也需要特定的空间结构来与底物或配体进行精确匹配[10]。环状结构中的π电子共轭系统可以影响分子的电子分布和性质,从而影响其与其他分子的相互作用[11]。同时,PQQ的分子中存在着1个氧活性位点,这使其具有独特的氧化还原特性,能高效可逆地在还原剂与氧化剂之间转移电子,表现出抗氧化和促氧化的双重特性,这使其能够在生物反应中充当氧化还原辅因子[7]。
2 PQQ的来源和生物合成
PQQ广泛存在于植物、某些细菌以及动物组织中,最初在甲烷营养细菌中被发现并被鉴定为谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)和苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)等氧化还原酶的辅因子[12]。土壤和土壤细菌是植物获取PQQ的主要来源,而动物从常见食物中获取PQQ,如茶叶、木瓜、猕猴桃和大豆等都含有PQQ[13]。经液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)检测,蔬菜、发酵制品等食品中的游离PQQ含量为0.19~7.02 ng/g[14]。尽管PQQ不能在哺乳动物体内合成,但在众多动物和人类组织中检测到了微量的PQQ,其含量范围在pmol至nmol级之间,这表明PQQ很容易通过外部途径摄入[15]。PQQ的化学合成成本较高,微生物合成产量偏低,因此开发有效的菌株和动态发酵策略以提高PQQ产量对于满足大规模工业需求具有重要意义[16]。之后的研究采用随机诱变和适应性实验室进化(adaptive laboratory evolution,ALE)与发酵优化的联合策略来提高脱氮生丝微菌H4-45(Hyphomicrobium denitrificans H4-45)中PQQ的生产,获得了PQQ高产突变菌株并在发酵中实现了系统高产PQQ的策略[17]。
PQQ在微生物中的合成来自于氨基酸链的修饰,由基因编码的前体肽上的酪氨酸(Tyr)和谷氨酸(Glu)残基合成[18]。遗传研究已经确定了一个名为pqq的操纵子,其中包含pqqA~pqqF 6个保守的PQQ生物合成所需的基因,分别表达PqqA~PqqF 6种酶或蛋白参与或控制PQQ合成的不同阶段[19]。从PqqA的产生到PQQ的合成涉及至少6分子蛋白、5分子氧气(O2)、1分子S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)以及电子供体系统的参与[20]。首先pqqA被翻译成一条包含Glu和Tyr残基的保守短肽——PqqA。PqqD与PqqE在SAM的存在下使PqqA内产生Gul-Tyr交联,随后被PqqF和PqqG复合酶从N端和C端水解掉其他氨基酸残基,剩下的Gul-Tyr二肽交联产物被PqqB羟基化修饰并自发环化产生PQQ合成的前体物质AHQQ,PqqC以3a-(2-氨基-2-羧乙基)-4,5-二氧代-4,5,6,7,8,9-六氢喹啉-7,9-二羧酸(AHQQ)为底物消耗3分子O2和8个电子最终生成PQQ[8,20-21]。
3 PQQ的生物学功能
3.1 PQQ在动物能量代谢中的作用
纤维素在动物消化过程中具有刺激胃肠道蠕动和改善消化道环境的作用,一些胃肠道微生物可分泌多种酶将纤维素分解成单糖或其他衍生物,从而为动物提供能量[22]。研究者在灰盖拟鬼伞(Coprinopsis cinerea)中发现了一种依赖PQQ的吡喃糖脱氢酶(pyranose dehydrogenase,PDH),其含有1个PQQ辅因子的新型中央催化域且对纤维素具有很高的亲和力,这表明PQQ可能参与植物细胞壁的降解,有助于生物降解和生物量转化研究[23]。灰盖拟鬼伞PDH还能够氧化多种稀有糖类,包括2-酮-D-葡萄糖、L-岩藻糖以及D-阿拉伯糖和L-半乳糖等[23-24]。此外,乳酸是动物细胞进行糖酵解过程产生的代谢产物,在瘤胃内过量积累可导致奶牛发生酸中毒[25]。PQQ可以作为乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的辅因子,其对LDH活性具有一定影响,比如在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)存在的情况下,PQQ能增强LDH促进丙酮酸生成的能力,并抑制乳酸的累积[26]。此外,研究揭示,PQQ可能作为大肠杆菌膜结合己糖和乙醇脱氢酶的辅因子参与葡萄糖酸的合成,进而促进丁酸产量的提升[26]。丁酸在反刍动物的消化系统及整体健康方面发挥着诸多正面作用,包括促进能量代谢、改善胰岛素抗性和增强线粒体功能等[27]。线粒体作为细胞的“能量工厂”,其数量的增加和功能的改善对细胞的生理活动至关重要[28]。PQQ能够激活沉默信息调节因子1(SIRT1),进而激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)介导的细胞信号通路[26]。这使得PQQ能够与细胞内的线粒体相互作用,提升线粒体的功能及数量,进而优化脂质代谢和促进能量产生[29-31]。同时,PQQ特殊的生物活性使其能够在生物体内促进线粒体生物合成并减轻线粒体功能障碍[32]。这不仅为细胞提供了更多的能量,而且还在一定程度上提升了细胞的能量代谢效率。
3.2 PQQ在动物氧化还原状态中的作用
氧化应激是指机体内氧化与抗氧化状态的失衡,状态倾向于氧化方向并产生大量的氧化中间体,如活性氧(ROS)类物质等[33]。当其浓度达到机体所能承受的最大极限时,可能会引发一系列有害的生物化学反应,如蛋白质变性、DNA损伤以及细胞信号转导通路的异常改变等[34]。PQQ可以在醌与缩醛形态之间转化,它的醌环结构在氧化还原反应中充当活性位点,从而影响细胞内的氧化还原平衡状态,并保护细胞免受氧化损伤[35]。此外,PQQ还可以通过形成氧活性物质发挥促氧化作用,通过特定条件下的氧化还原循环诱导蛋白质氧化修饰,如半胱氨酸巯基的氧化[36]。同时,PQQ也能够广泛的氧化糖类、醇类、胺类和醛类等底物,如一种醌依赖性醇脱氢酶,其活性位点更加开放、易于接近,使其更易与底物结合[37]。PQQ的抗氧化特性主要通过其优异的自由基清除能力和对氧化应激的减轻得以体现。PQQ能够有效中和自由基的连锁反应,通过参与调节细胞的抗氧化防御系统,减少氧化应激,帮助维护细胞的完整性和功能[38]。早期研究将PQQ视为一种单线态氧清除剂。Mukai等[39]的胶束试验表明,PQQH2的二级反应速率常数可达9.85×108 mol/(L·s),是维生素C的6.32倍,但这并未回答生理条件下该反应是否足以对抗系统性氧化应激。随后,Harris等[40]把3月龄Wistar大鼠置于100% O2环境中,发现补饲PQQ可在行为学层面阻断高氧诱导的早发性记忆衰退,补饲组大鼠显示出比非补饲对照组具有更好的学习和记忆能力。更进一步,在哺乳动物组织和牛奶中发现存在PQQ,且有研究指出其能够替代黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)在血红素还原酶和13-羟基-13-甲基戊二酰辅酶A还原酶中的作用[41],说明PQQ不仅能“被动”清除ROS,还可“主动”代偿关键氧化还原辅酶,从而把抗氧化角色从“化学淬灭”提升到“代谢通路替代”。Nunome等[42]在6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的SH-SY5Y细胞模型中证实,PQQ通过特异性降低原代培养神经元中DJ-1基因的表达水平,阻断氧化应激触发的神经元凋亡,将保护机制精确到单一蛋白分子尺度。综上可知,PQQ的研究脉络呈现从宏观抗氧化到单一分子机理研究的趋势。
3.3 PQQ在动物免疫系统中的作用
研究揭示,通过补充PQQ能够促进动物的生长以及生长相关基因的表达,并对免疫相关的血清指标产生积极影响[43]。具体而言,一方面,PQQ能够显著提升动物血清免疫球蛋白含量,强化其免疫功能[44];另一方面,肠道屏障功能的损伤会导致细菌、内毒素、细菌DNA以及其他代谢产物渗透进入宿主的血液循环引起动物发病[45],而PQQ能够增加紧密连接蛋白的mRNA表达水平,帮助维持肠道屏障的完整性,进而防止有害物质进入血液循环[26]。此外,研究显示,每日摄入0.3 mg/kg BW的PQQ后,血浆中C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量出现显著下降,二者是反映炎症状态的关键生物标志物,这表明PQQ可能具备抗炎功能[46]。同时,PQQ能够通过促进免疫细胞的增殖和提高其活性来强化细胞免疫功能。具体来说,PQQ能够提高动物机体抗氧化酶的活性,从而维持免疫细胞的完整性,减轻炎症反应[47]。此外,PQQ还能增强巨噬细胞的吞噬功能,帮助动物更有效地消除病原体,提高整体的免疫能力[48]。在细胞层面,吡咯喹啉醌二钠(PQQNa2)能够通过抑制核因子-κB(NF-κB)信号通路,有效增强断奶仔猪的免疫能力[49]。PQQ通过调节炎症相关信号通路,减少炎症因子的释放,从而发挥抗炎效果,并可以通过影响免疫细胞的活性,抑制过度的免疫反应,从而在自身免疫性疾病中发挥潜在的治疗作用[50]。此外,PQQ还在细胞生长和生物合成过程中起作用,它能够刺激上皮细胞增殖,激活表皮生长因子受体,从而可能在伤口愈合和组织修复中发挥作用[38]。虽然关于PQQ对微生物群落组成或功能影响的研究不多,但目前普遍认为,某些肠道细菌可能需要PQQ来实现最佳功能,从而调节肠道菌群稳态,达到对肠道免疫的调节作用[51-53]。
4 PQQ在动物生产中的应用
目前PQQ在动物中的研究多集中在小鼠、鸡和猪上,在反刍动物上的研究鲜有报道。断奶是仔猪生产中的一个关键阶段,仔猪在此过程中会面临环境和心理压力,导致采食量降低、体重增长缓慢,同时腹泻和死亡风险升高[52]。随着禁止使用抗生素来预防仔猪的断奶应激,寻找抗生素替代品成为研究热点。研究表明,围产期饲粮添加PQQ能够显著提升初生仔猪及母猪血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,并提高还原型谷胱甘肽(GSH)含量,同时显著降低血清丙二醛(MDA)含量[53],提示PQQ可在系统水平抑制脂质过氧化。该现象在细胞水平上被证实是依赖核因子E2相关因子2(Nrf2)及其下游靶基因血红素加氧酶-1(HO-1)信号通路,使IPEC-J2细胞核内Nrf2蛋白表达上调,随后使HO-1蛋白表达上调并使B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)与B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平比值升高[54]。肠黏膜形态改善与腹泻率降低可视为Nrf2下游抗氧化-抗凋亡表型在消化道的延伸[54]。值得注意的是,当断奶仔猪在同等改善生长性能、营养物质消化率、抗氧化能力和神经调节效果下,在基础饲粮中仅需添加3.0 mg/kg PQQ,而氧化锌需添加1 600 mg/kg[55],说明PQQ不依赖高剂量离子效应,其分子开关作用值得进一步解析。综上所述,现有研究把PQQ的“抗氧化-肠道-生长”三联效应初步锚定在Nrf2/HO-1轴,但其他细节如PQQ与磷酸化位点及与DJ-1、单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)等已知感受器的相互作用尚待阐明。
在家禽生产中,通过现代育种技术培育出的高产蛋鸡品系,虽然显著提升了产蛋效率,却使禽体肝脏承受更大的代谢压力,进而诱发氧化应激,最终可能会引发一系列与肝脏代谢相关的功能障碍[56-57]。PQQ能够提高爱拔益加肉仔鸡全净膛率和胸肌率,通过调节血浆脂质代谢和提高肝脏抗氧化能力,缓解氧化应激对肉仔鸡的不利影响[53,58-59]。龙城等[60]在探究基础饲粮添加不同水平PQQNa2对种公鸡繁殖性能的影响研究中发现,1.0 mg/kg PQQNa2对种公鸡抗氧化能力、睾丸生精小管直径和生精上皮厚度的改善效果最佳。吴炜杭等[61]在PQQ对蛋鸡肝脏脂质代谢的影响研究中发现,PQQ与α-月桂酸单甘油酯(α-GML)复配使用能够调节海兰褐蛋鸡肝脏脂质代谢,减少肝脏脂质沉积。还有研究表明,在蛋鸡饲粮中添加适量PQQNa2能够显著改善其生产性能,提高饲料利用率,同时有效改善鸡蛋哈氏指数和蛋壳硬度[62-63]。值得注意的是,蛋鸡的生产效率及蛋品质量,尤其是蛋壳和蛋白的品质,极易受到氧化应激的负面影响。这种应激反应会损害输卵管组织功能,干扰蛋壳和蛋白的形成过程,最终导致蛋壳硬度和厚度降低,使蛋品质下降[64]。同时,氧化应激会显著降低蛋鸡产蛋率和采食量,进而导致饲料转化效率降低[65]。PQQ卓越的抗氧化特性能够有效缓解这些不良影响,为开发新型功能性饲料添加剂提供了重要依据。
5 PQQ作为功能性饲料添加剂的应用前景
在一些研究中,已经观察到PQQ缺乏会导致动物生长迟缓和发育不良,这表明其对生物体的健康和正常生理功能具有重要作用[38]。PQQ在饮食中的稳定性较差,可能需要通过其他形式来吸收和利用,并可能通过影响胶原的成熟和表达来影响动物生长[41]。PQQNa2被认为是一种有效的饲料添加剂,能够提高饲料效率,对促进动物生长和减少饲料浪费具有重要意义[66]。2008年,美国食品药品监督管理局(FDA)批准PQQNa2作为新食品成分,并于2009年起在美国实现商业化应用。欧洲食品安全局(EFSA)对PQQ的安全性进行了评估,动物试验和人体临床试验均未发现不良反应,表明PQQ作为营养补充剂具有高度的安全性。此外,多项毒理学研究也未发现PQQ具有明显的急性或亚慢性毒性作用,而现如今PQQ也已经在日本和欧盟获批作为食品添加剂使用[8,67]。这均体现了PQQ用作功能性饲料添加剂的潜力。在今后的研究中,了解PQQ在动物体内的吸收、转化、代谢和排泄,对于评估其作为功能性食品成分或补充剂的潜力至关重要[38]。同时,PQQ在反刍动物中的作用效果也是十分具有研究价值的议题。
6 小结
PQQ作为一种具有生物活性的水溶性醌类化合物,凭借其独特的化学结构及优异的理化特性,在动物营养学领域展现出广阔的应用前景。PQQ参与生物体内的代谢过程并具有较高的稳定性和可靠性,对营养和能量代谢具有重要影响,可能参与纤维素降解、乳酸代谢以及线粒体生物合成等过程,从而优化能量代谢效率。其优良的抗氧化特性对缓解动物免疫和应激反应有较强作用,已在猪、鸡饲喂试验中得到验证。未来的研究应进一步探索PQQ在不同动物中的作用效果,深入研究其在动物体内的代谢过程,以更好地评估其作为功能性饲料添加剂的潜力。