Chinese Journal of Animal Nutrition >

2026 , Vol. 38 >Issue 4: 2651 - 2662

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.213

RESEARCH PAPER

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process for Rhodotorula mucilaginosa and Its Fermentation Product Application in Production of Laying Hens

  • WEI Haoran , 1 ,
  • QI Xiaoting 2 ,
  • AN Jing 1 ,
  • ZHOU Caihua 1 ,
  • ZHANG Huixin 1 ,
  • ZHENG Mengli 1 ,
  • LIU Tao 3 ,
  • HUANG Yanling 2 ,
  • ZHAO Huili 4 ,
  • WANG Haiwang 4 ,
  • XING Shihai 4 ,
  • ZHANG Tieying , 1, *
Expand
  • 1 State Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
  • 2 College of Animal Science and Veterinary Medicine, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China
  • 3 Ordos City Xinnong Breeding Company Limited, Ordos 017000, China
  • 4 Beijing Deqingyuan Agricultural Science and Technology Company Limited, Beijing 100089, China
*professor, E-mail: .

Received date: 2025-08-18

  Online published: 2026-04-14

Fold

Abstract

This experiment was conducted to study the optimization of enzymatic hydrolysis process for Rhodotorula mucilaginosa and its fermentation product application in production of laying hens. The in vitro enzymatic hydrolysis experiment used a single-factor experiment, to study the effects of compound enzyme (acidic mannanase and β-glucanase) addition amount and addition ratio, enzymatic hydrolysis time, enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis pH on carotenoid extraction rate of Rhodotorula mucilaginosa mutant strain CS-15. Further optimization of process conditions for carotenoids from Rhodotorula mucilaginosa by enzymatic method using Box-Behnken response surface methodology. A total of 180 Hy-Line brown laying hens aged at 22 weeks with similar body condition were randomly assigned to 3 groups with 6 replicates per group and 10 hens per replicate. The laying hens in group A (control group) were fed a basal diet, and others in group B and group C were fed basal diets supplemented with 1% and 2% Rhodotorula mucilaginosa fermentation product, respectively. The pre-experimental period lasted for 3 days, and the experimental period lasted for 28 days. The results showed as follows: 1) the optimal addition ratio of compound enzyme was acidic mannanase∶β-glucanase=1∶2, and the optimal addition amount was 100 mg/L. Under the addition ratio and addition amount, the carotenoid extraction rate reached 63.14%. The optimal process conditions were hydrolysis time of 5 h, hydrolysis pH of 4.5 and hydrolysis temperature of 50 ℃. Under these conditions, the predicted carotenoid extraction rate was 75.51%, and the actual extraction rate was (74.50±0.18)%. 2) The yolk Roche color level and carotenoid content at various time points of group B and group C were significantly higher than those of the control group (P<0.05), and group C was significantly higher than group B (P<0.05). There were no significant differences in egg production rate, eggshell strength and eggshell thickness et al among all groups (P>0.05). In conclusion, the experiment optimizes the conditions for extracting carotenoids from Rhodotorula mucilaginosa by enzymatic hydrolysis using compound enzyme, and through animal experiments, it has been confirmed that the Rhodotorula mucilaginosa fermentation product can safely replace synthetic additives, effectively improve the yolk color and nutritional value of eggs.

Key words： Rhodotorula mucilaginosa; carotenoids; enzymatic hydrolysis process; laying hens; egg quality

Cite this article

WEI Haoran , QI Xiaoting , AN Jing , ZHOU Caihua , ZHANG Huixin , ZHENG Mengli , LIU Tao , HUANG Yanling , ZHAO Huili , WANG Haiwang , XING Shihai , ZHANG Tieying . Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process for Rhodotorula mucilaginosa and Its Fermentation Product Application in Production of Laying Hens[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2026 , 38(4) : 2651 -2662 . DOI: 10.12418/CJAN2026.213

胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)含有丰富的类胡萝卜素、矿物质和有机酸[1],作为饲料添加剂具有多重功效。其中,类胡萝卜素能有效清除自由基,减轻氧化应激反应,增强机体抗氧化能力[2];同时可改善动物产品色泽,提升商品价值[3]。胶红酵母还能优化肠道微生态环境,促进营养物质的消化吸收[4]。在蛋鸡上的研究表明,饲粮中添加胶红酵母能提高鸡蛋品质,加深蛋黄颜色,同时增强蛋鸡的免疫功能和健康状况[5]。
胶红酵母细胞壁主要由3层结构构成,从外至内依次为甘露聚糖、蛋白质和β-葡聚糖,并含有少量几丁质[6]。胶红酵母细胞壁结构厚且坚韧,显著阻碍胞内类胡萝卜素的提取效率。同时,类胡萝卜素对光、热、氧等外界因素极为敏感,易在提取过程中发生降解,严重影响其产品价值。因此,开发高效、温和且能够最大限度保护色素稳定性的提取方法至关重要。目前,从酵母中提取类胡萝卜素的常用方法包括研磨法、冻融法和酸热法。研磨法和冻融法操作相对简便,但容易因机械力或温度变化引起类胡萝卜素结构破坏,导致色素产量损失较大,提取效率有限[7-8]。酸热法[9]虽具较好的破壁效果且操作简单,但对沸水浴时间控制要求严格,高温和酸性环境会加剧类胡萝卜素的氧化降解,因而也难以实现高效、低损耗的提取目标。
针对以上问题,本研究选用酸性甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶组成复合酶体系进行酶解法破壁。该策略的核心优势在于2种酶可分别靶向降解细胞壁中的关键组分——甘露聚糖和β-葡聚糖,实现精准、高效破壁[10]。该酶解过程条件温和,无需极端温度或强化学试剂,可减少类胡萝卜素在提取过程中因热、光、氧引起的降解,同时避免传统方法对色素结构的破坏,从而兼顾破壁效率和产物稳定性。
蛋黄色泽是衡量蛋品商品价值的关键属性之一,其罗氏(Roche)色度等级直接影响消费者的购买决策和市场定价。胶红酵母作为功能性饲料添加剂,能够通过生物富集类胡萝卜素有效改善蛋黄颜色[11]。谢爱娣等[12]研究报道,使用30%破壁红酵母固态发酵产物替代基础饲粮饲喂蛋鸡8 d后,与对照组相比,试验组蛋黄的Roche色度等级显著提高,类胡萝卜素沉积量显著提高,且产蛋率无显著变化。
因此,本研究采用温和、安全的酶解法对胶红酵母突变菌株CS-15进行破壁处理,通过单因素试验和响应面法优化复合酶解工艺参数,致力于建立一种绿色、高效且对色素无害的类胡萝卜素提取工艺;此外,进一步将破壁后的胶红酵母发酵产物应用于蛋鸡饲粮,系统评价其对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响,以期为胶红酵母在类胡萝卜素工业化生产及蛋鸡饲粮中的科学应用提供理论依据与实践支持。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

胶红酵母突变菌株CS-15,由本实验室通过野生胶红酵母菌株ATCC 9949经诱变后分离鉴定,其类胡萝卜素产量为24.09 mg/L。

1.2 试验试剂与仪器设备

主要试验试剂:β-葡聚糖酶(3 300 U/mg,上海源叶生物科技有限公司)、酸性甘露聚糖酶(4 000 U/mg,济南百斯杰生物工程有限公司)以及葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物(北京市通广精细化工公司)。
主要试验仪器与设备:恒温培养箱(SPX-250B,北京天林恒泰科技有限公司)、全温振荡培养箱(ZWY-2102C,苏州培英实验设备有限公司)、酸度计(PHS-3C,上海仪电科学仪器股份有限公司)、生物显微镜(CX31,北京汗盟紫星仪器仪表有限公司)、洁净超净台(SW-CJ-2FD,北京东联哈尔仪器制造有限公司)、电子天平(FA2004,上海精密科学仪器有限公司)、游标卡尺(500-196-30,日本Mitutoyo公司)、多功能蛋品质分析仪(EMT-7300 Ⅱ,日本Robotmation公司)、蛋壳强度测定仪(RH-DQ200,北京瑞华世纪科技有限公司)。

1.3 培养基

YPD培养基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母粉1%,于115 ℃灭菌25 min。
发酵培养基:葡萄糖58.97 g/L,蛋白胨5.86 g/L,酵母粉2.93 g/L,磷酸二氢钾1 g/L,七水硫酸镁1.5 g/L,氯化钠24.68 g/L,于115 ℃灭菌25 min。

1.4 胶红酵母的培养方法

1.4.1 种子培养

挑取一株长势良好的单菌落于25 mL YPD培养基的250 mL三角瓶中,在28 ℃、220 r/min的摇床中培养48 h。

1.4.2 发酵培养

将种子液的吸光度(OD)值稀释到1.0,按10%的接种量接种于25 mL发酵培养基中,28 ℃、220 r/min振荡培养72 h。

1.5 酶解工艺优化的单因素试验设计

复合酶最佳添加量的确定方法:将酶活性分别为4 000 U/mg的酸性甘露聚糖酶和3 300 U/mg的β-葡聚糖酶按1∶1质量比配制成10 g/L的复合酶母液,分别添加至发酵体系中,使其终浓度分别达到0、5、10、50、100、500 mg/L。固定酶解条件为45 ℃、pH 4.0、220 r/min振荡6 h,反应完成后测定类胡萝卜素提取率,以确定复合酶最佳添加量。
复合酶最佳添加比例的确定方法:设置甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶的比例分别为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、2∶3、3∶2、3∶1,以复合酶最佳添加量添加至发酵体系中,固定酶解条件为45 ℃、pH 4.0、220 r/min振荡6 h,反应完成后测定类胡萝卜素提取率,以确定复合酶最佳添加比例。
基于上述复合酶的添加条件,采用单因素试验优化酶解工艺参数,考察酶解时间(3、4、5、6、7 h)、酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)和酶解pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)对类胡萝卜素提取率的影响。试验中固定其他酶解条件不变,每个处理3个重复,试验结束后立即测定类胡萝卜素提取率。

1.6 酶解工艺优化的响应面试验设计

利用Box-Behnken 响应面法进一步优化酶解工艺条件,固定复合酶最佳添加比例和最佳添加量,自变量为酶解时间、酶解温度、酶解pH,以类胡萝卜素提取率作为响应值。

1.7 类胡萝卜素提取率测定

类胡萝卜素提取率用于评价不同酶解工艺对细胞壁的破坏效果,其定义为:在特定酶解条件下,单次丙酮提取所获得的类胡萝卜素含量占未经酶解处理的原始菌体中类胡萝卜素理论总含量的百分比[13]。
测定步骤:取2 mL经酶解处理的发酵液,离心收集菌体,洗涤后加入5 mL丙酮,28 ℃避光浸提1 h,离心后测定上清液475 nm波长下的吸光度值(ODs)。为获取类胡萝卜素理论总含量,另取等量未经酶解处理的原始菌体,采用相同方法反复提取直至提取液无色(吸光度值变化小于5%),累计各次提取液吸光度值之和(ODt),按以下公式计算类胡萝卜素提取率:
类胡萝卜素提取率(%)=(ODs/ODt)×100。

1.8 动物试验

1.8.1 试验设计

本试验经中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物伦理委员会批准(批准号:IAS2024-185)。选取22周龄、体况相近的海兰褐蛋鸡180只,随机分为3组,每组6个重复,每个重复10只鸡。A组(对照组)饲喂基础饲粮,B组和C组分别在基础饲粮中添加1%和2%胶红酵母发酵产物。预试期为3 d,正试期为28 d。胶红酵母发酵产物为胶红酵母突变菌株CS-15经上述最优酶解破壁工艺(即复合酶比例1∶2,添加量100 mg/L,于50 ℃、pH 4.5条件下酶解5 h)处理,并后续通过发酵、提取及干燥等工艺制备而成的固体发酵产物,其活菌数为4.32×108 CFU/g。基础饲粮参考NRC(1994)和《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制,其组成及营养水平见表1。
表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 61.00
豆油Soybean oil 1.85
豆粕Soybean meal 22.00
石粉Limestone 8.00
磷酸氢钙CaHPO4 1.40
菜籽粕Rapeseed meal 3.00
麸皮Wheat bran 1.50
食盐NaCl 0.30
DL-蛋氨酸DL-methionine 0.12
L-赖氨酸L-lysine 0.08
氯化胆碱Choline chloride 0.10
维生素预混料Vitamin premix1) 0.15
矿物质预混料Mineral premix2) 0.50
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels3)
代谢能ME/(MJ/kg) 11.80
粗蛋白质CP 16.50
粗纤维CF 5.50
钙Ca 3.80
总磷TP 0.65
蛋氨酸Met 0.38
蛋氨酸+胱氨酸Met+Cys 0.71
赖氨酸Lys 0.85

1)维生素预混料为每千克饲粮提供 The vitamin premix provided the following per kilogram of the diet: VA 12 000 IU,VD3 3 500 IU,VE 35 IU,VK3 2.5 mg,VB1 3.5 mg,VB2 9.00 mg,VB6 5.0 mg,VB12 0.015 mg,烟酸 niacin 50 mg,泛酸钙 calcium pantothenate 15 mg。
3)代谢能为计算值,参考《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004);其他营养水平为实测值,粗蛋白质含量参照GB/T 6432—2018的方法测定,粗纤维含量参照GB/T 6434—2022的方法测定,钙含量参照GB/T 6436—2018的方法测定,总磷含量参照GB/T 6437—2018的方法测定,氨基酸含量参照GB/T 18246—2019的方法测定。ME was a calculated value, referred to Feeding Standard for Chickens (NY/T 33—2004); while other nutrient levels were measured values, CP content was determined according to GB/T 6432—2018, CF content was determined according to GB/T 6434—2022, Ca content was determined according to GB/T 6436—2018, TP content was determined according to GB/T 6437—2018, amino acid contents were determined according to GB/T 18246—2019.

2)矿物质预混料为每千克饲粮提供 The mineral premix provided the following per kilogram of the diet:Fe 120 mg,Cu 12 mg,Zn 110 mg,Mn 130 mg,I 12.0 mg,Se 0.4 mg。

1.8.2 饲养管理与样品采集

蛋鸡采用3层笼养方式,分别在09:00、14:00给料,鸡舍光照时间为每天16 h。每天10:00收集鸡蛋,清理鸡粪并进行消毒。控制鸡舍温度和相对湿度,试验过程按照正常免疫程序进行免疫,试验全程记录产蛋数据,并按鸡蛋大小分级别挑拣,每周称取蛋重,计算各组的蛋重和产蛋率。于试验期第7、14、21、28天下午(14:00—16:00)采集鲜蛋样本,每重复随机选取5枚典型蛋样(共30枚/组),取样后当天完成蛋品质指标测定。

1.8.3 蛋黄类胡萝卜素的提取和含量测定

收集蛋黄并搅拌均匀,准确称取0.5 g样品,加入10 mL丙酮后涡漩振荡15 min以充分提取色素,8 000×g离心15 min并收集上清液,重复该提取过程直至蛋黄为白色[14]。合并所有上清液后,使用紫外-可见分光光度计在475 nm处测定吸光度值。类胡萝卜素含量按下列公式计算:
类胡萝卜素含量(μg/g)=A×V/(0.16×W)。
式中:A为475 nm处吸光度值;V为丙酮体积(mL);0.16为胡萝卜素的摩尔消光系数;W为蛋黄重量(g)。

1.8.4 产蛋率和蛋品质指标测定

产蛋率根据日产蛋数与鸡只数量的百分比计算得出。蛋壳强度:采用蛋壳强度测定仪垂直加压钝端测定;蛋形指数:通过游标卡尺测量鸡蛋横径与纵径比值获得;蛋黄比例:使用蛋白蛋黄分离器分离蛋黄和蛋白后,由电子天平测定蛋黄和蛋白质量,计算蛋黄百分比;蛋壳厚度在鸡蛋赤道部位对称选取3个测量点取平均值,并避开气室和尖端区域;蛋黄颜色(Roche色度等级)通过多功能蛋品质分析仪进行测定。

1.9 数据统计与分析

使用Design-Expert 8.0软件对体外酶解试验数据进行拟合,建立了类胡萝卜素提取率的二次回归方程,并对该模型进行方差分析,以预测最佳酶解提取条件。
动物试验数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析,图表绘制采用GraphPad Prism 8.0完成。通过一般线性模型(GLM)程序进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用最小显著差异(LSD)法进行组间多重比较,以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 单因素优化试验结果

如图1所示,类胡萝卜素提取率随复合酶添加量的增加而提高,复合酶添加量为100和500 mg/L时的类胡萝卜素提取率显著高于复合酶添加量为0、5、10和50 mg/L时(P<0.05)。综合考虑复合酶的添加成本,选择复合酶最佳添加量为100 mg/L。复合酶添加比例为1∶2的类胡萝卜素提取率达到63.14%,显著高于其他复合酶添加比例(P<0.05)。因此,选择复合酶最佳添加比例1∶2。
图1 复合酶添加量和添加比例对类胡萝卜素提取率的影响

数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

Fig.1 Effects of compound enzyme addition amount and addition ratio on carotenoid extraction rate

Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

如图2所示,类胡萝卜素提取率随酶解时间呈先升高后降低的趋势,酶解时间为5 h时的类胡萝卜素提取率显著高于酶解时间为3、4、6、7 h时(P<0.05)。类胡萝卜素提取率随酶解温度呈先升高后降低的趋势,酶解温度为50 ℃时的类胡萝卜素提取率显著高于酶解温度为40、45、55、60 ℃时(P<0.05)。酶解pH为4.5时的类胡萝卜素提取率显著高于酶解pH为4.0、5.5、5.5、6.0时(P<0.05)。
图2 酶解时间、酶解温度和酶解pH对类胡萝卜素提取率的影响

Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis time, enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis pH on carotenoid extraction rate

2.2 响应面试验结果

如表2所示,使用Design-Expert 8.0软件对数据进行回归拟合,自变量为酶解时间(A)、酶解温度(B)、酶解pH(C),得到类胡萝卜素提取率(Y)的二次回归方程如下:
Y=75.51+1.46A-0.77B-2.25C+2AB+1.59AC-1.72BC-1.94A2-5.83B2-8.63C2。
表2 响应面试验设计及结果

Table 2 Response surface experimental design and results

项目
Items		 酶解时间
Enzymatic hydrolysis
time (A)/h		 酶解温度
Enzymatic hydrolysis
temperature (B)/℃		 酶解pH
Enzymatic hydrolysis
pH (C)		 类胡萝卜素提取率
Carotenoid extraction
rate (Y)/%
1 5 45 4.0 61.97
2 4 50 5.0 59.63
3 5 55 4.0 64.94
4 6 50 5.0 66.05
5 4 55 4.5 63.12
6 5 45 5.0 60.59
7 4 45 4.5 69.74
8 5 50 4.5 77.00
9 4 50 4.0 67.02
10 5 50 4.5 75.62
11 6 45 4.5 68.37
12 5 50 4.5 73.91
13 6 55 4.5 69.74
14 6 50 4.0 67.06
15 5 55 5.0 56.68
如表3所示,试验选用的模型极显著(P<0.01),方差失拟项不显著(P>0.05),说明模型拟合精度好,可以利用该响应面模型进行后续的优化设计;此外,回归模型的决定系数(R2)=0.986 4,表明二次回归方程与试验结果的拟合度良好,可以用于复合酶提取胶红酵母类胡萝卜素的分析与预测。同时,酶解pH(C)、酶解pH二次项(C2)极显著(P<0.01),酶解时间(A)、酶解时间和酶解温度交互项(AB)、酶解时间和酶解pH交互项(AC)、酶解温度和酶解pH交互项(BC)、酶解时间二次项(A2)、酶解温度二次项(B2)均显著(P<0.05),说明这几个因素对类胡萝卜素提取率影响较大,各因素对类胡萝卜素提取率的影响程度的大小顺序依次为:酶解pH>酶解时间>酶解温度。
表3 二次多项式回归模型的方差分析

Table 3 Analysis of variance for quadratic polynomial regression model

方差来源
Variance sources		 平方和
Sum of squares		 自由度
Variance		 均方
Mean square		 F值
F-value		 P值
P-value
模型Model 478.02 9 53.11 35.46 0.000 5
A 17.14 1 17.14 11.44 0.020 0
B 4.79 1 4.79 3.20 0.133 8
C 40.68 1 40.68 27.16 0.003 4
AB 15.96 1 15.96 10.66 0.022 3
AC 10.18 1 10.18 6.79 0.047 9
BC 11.83 1 11.83 7.90 0.037 5
A2 13.84 1 13.84 9.24 0.028 8
B2 125.55 1 125.55 83.82 0.000 3
C2 275.23 1 275.23 183.75 <0.000 1
残差Residual 7.49 5 1.5
失拟项Lack of fit 2.7 3 0.9 0.38 0.783 9
误差项Pure error 4.79 2 2.4
总和Total 485.51 14
决定系数R2 0.986 4

A:酶解时间 enzymatic hydrolysis time;B:酶解温度 enzymatic hydrolysis temperature;C:酶解pH enzymatic hydrolysis pH。

响应面的陡峭程度和等高线的形状可以反映2种因素之间的交互作用程度。如图3-A及对应的等高线图3-a所示,酶解温度与酶解pH之间的交互作用最大,这体现在响应面曲面的陡峭变化以及等高线沿温度轴呈现明显的密集分布特征。相比之下,酶解pH轴方向的等高线分布相对密集,表明在试验参数范围内,酶解pH对类胡萝卜素提取率的影响大于酶解温度。如图3-B和图3-C及对应的等高线图3-b和图3-c所示,酶解时间与其他因素的交互作用曲面相对平缓,等高线分布也较为均匀,说明酶解时间对类胡萝卜素提取率的影响程度低于酶解温度和酶解pH。这种响应面形态特征与表3方差分析所得的显著性结果吻合,验证了试验数据的可靠性。
图3 2种因素交互作用的响应面和等高线图

A:酶解时间与酶解温度交互作用响应面图;B:酶解时间与酶解pH交互作用响应面图;C:酶解pH与酶解温度交互作用响应面图;a:酶解时间与酶解温度交互作用等高线图;b:酶解时间与酶解pH交互作用等高线图;c:酶解pH与酶解温度交互作用等高线图。

Fig.3 Response surface and contour plots of two-factor interactions

A: response surface plot of enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis temperature interaction; B: response surface plot of enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis pH interaction; C: response surface plot of enzymatic hydrolysis pH and enzymatic hydrolysis temperature interaction; a: contour plot of enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis temperature interaction; b: contour plot of enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis pH interaction; c: contour plot of enzymatic hydrolysis pH and enzymatic hydrolysis temperature interaction.

通过Design-Expert 8.0分析优化,得出酶解法提取胶红酵母类胡萝卜素的最佳工艺条件为:酶解时间5 h、酶解pH 4.5、酶解温度50 ℃。在此条件下,类胡萝卜素提取率预测值为75.51%。经上述优化工艺条件提取后,胶红酵母类胡萝卜素提取率为(74.50±0.18)%,与预测值相比,相对误差为1.33%。因此,响应面优化后的工艺条件是可行的,具有实用价值。

2.3 胶红酵母发酵产物对蛋鸡产蛋率的影响

在整个试验期内,A组、B组和C组的平均产蛋率分别为(79.88±1.52)%、(76.48±2.15)%和(79.23±2.94)%,统计分析结果表明各组平均产蛋率无显著差异(P>0.05)。这表明饲粮中添加1%和2%胶红酵母发酵产物对蛋鸡的产蛋率未产生影响。

2.4 胶红酵母发酵产物对蛋鸡蛋品质的影响

如表4所示,第7天,A组蛋形指数显著高于B组和C组(P<0.05),各组之间第14、21、28天蛋形指数差异均不显著(P>0.05)。各组之间第7、14、21、28天蛋壳强度、蛋黄比例、蛋壳厚度、哈夫指数差异均不显著(P>0.05)。这表明胶红酵母未对蛋品质产生明显不利影响。
表4 胶红酵母发酵产物对蛋鸡蛋品质的影响

Table 4 Effects of Rhodotorula mucilaginosa fermentation product on egg quality of laying hens

项目
Items		 组别
Groups		 第7天
Day 7		 第14天
Day 14		 第21天
Day 21		 第28天
Day 28
蛋壳强度Eggshell strength/N A 46.40 48.79 50.76 51.01
B 44.28 48.66 49.61 48.52
C 47.89 45.07 44.35 51.97
均值标准误SEM 0.561 1.121 0.762 0.723
P值P-value 0.274 0.312 0.721 0.151
蛋黄比例Yolk ratio/% A 26.44 27.59 25.53 26.50
B 26.54 25.56 27.47 25.50
C 25.64 25.52 25.47 25.97
均值标准误SEM 0.022 0.062 0.052 0.025
P值P-value 0.372 0.342 0.321 0.381
蛋形指数Egg shape index A 0.80a 0.79 0.79 0.80
B 0.78b 0.79 0.75 0.78
C 0.79b 0.78 0.78 0.78
均值标准误SEM 0.122 0.032 0.072 0.072
P值P-value 0.012 0.962 0.052 0.052
蛋壳厚度Eggshell thickness/mm A 0.37 0.38 0.39 0.39
B 0.37 0.38 0.38 0.38
C 0.37 0.37 0.38 0.39
均值标准误SEM 0.021 0.022 0.023 0.025
P值P-value 0.892 0.571 0.261 0.621
哈夫指数Haugh index A 83.98 84.69 85.23 84.18
B 85.49 85.71 84.91 84.23
C 84.81 84.86 83.53 83.82
均值标准误SEM 0.401 0.361 0.521 0.761
P值P-value 0.311 0.461 0.371 0.362

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

如表5所示,对照组的蛋黄Roche色度等级在整个试验期内保持相对稳定,各时间点的蛋黄Roche色度等级在10.18~10.64,这表明在基础饲粮条件下蛋黄色泽未发生明显变化。B组的蛋黄Roche色度等级从11.97(第7天)提升至13.38(第28天)。C组的蛋黄Roche色度等级从12.57(第7天)增至13.93(第28天),接近市售土鸡蛋色泽标准[15-16]。组间对比显示,B组和C组在各时间点的蛋黄Roche色度等级均显著高于对照组(P<0.05),且C组显著高于B组(P<0.05)。
表5 胶红酵母发酵产物对鸡蛋蛋黄Roche色度等级的影响

Table 5 Effects of Rhodotorula mucilaginosa fermentation product on yolk Roche color level of eggs

项目Items 第7天Day 7 第14天Day 14 第21天Day 21 第28天Day 28
组别Groups
A 10.31c 10.64c 10.18c 10.43c
B 11.97b 12.27b 12.14b 13.38b
C 12.57a 13.17a 13.29a 13.93a
均值标准误SEM 0.027 0.114 0.192 0.197
P值P-value <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

2.5 胶红酵母发酵产物对鸡蛋蛋黄类胡萝卜素含量的影响

如表6所示,对照组的蛋黄类胡萝卜素含量在整个试验期内保持在较低水平(25.92~26.37 μg/g)。B组的蛋黄类胡萝卜素含量随着饲喂时间的延长而增加,从31.66 μg/g(第7天)增加至40.88 μg/g(第28天)。C组的蛋黄类胡萝卜素含量随着饲喂时间的延长而增加,从38.17 μg/g(第7天)增加至44.07 μg/g(第28天)。组间对比显示,B组和C组在各时间点的蛋黄类胡萝卜素含量均显著高于对照组(P<0.05),且C组显著高于B组(P<0.05)。
表6 胶红酵母发酵产物对鸡蛋蛋黄类胡萝卜素含量的影响

Table 6 Effects of Rhodotorula mucilaginosa fermentation product on yolk carotenoid content of eggs μg/g

项目Items 第7天Day 7 第14天Day 14 第21天Day 21 第28天Day 28
组别Groups
A 25.92c 24.97c 26.37c 26.37c
B 31.66b 34.83b 39.10b 40.88b
C 38.17a 39.75a 42.53a 44.07a
均值标准误SEM 1.141 1.402 1.623 1.714
P值P-value <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

3 讨论

3.1 复合酶解法优化胶红酵母类胡萝卜素提取工艺的研究

类胡萝卜素作为胶红酵母的次级代谢产物,其提取效率与细胞壁的破坏程度密切相关。为了提高类胡萝卜素提取率,本研究采用了复合酶解法,系统考察了酶解时间、酶解温度及酶解pH对类胡萝卜素提取率的影响,并与传统单一酶解法进行了对比分析。本试验结果表明,复合酶解法对红酵母类胡萝卜素的提取效果优于单一酶解法,这与前人研究结果[17]一致。在酶解时间优化试验中,类胡萝卜素提取率在5 h时达到峰值。在此时间范围内,复合酶能够高效作用于胶红酵母细胞壁,促进其分解,从而加速细胞内类胡萝卜素的释放。然而,超过5 h后,类胡萝卜素提取率反而呈现下降趋势,这可能与酶解反应的动态平衡有关。一方面,随着酶解过程的推进,酶促反应逐渐趋于完成;另一方面,过长的酶解时间可能导致酶的活性降低,同时类胡萝卜素因长时间暴露于外界环境而易于发生氧化降解[18]。因此,本研究最终确定最佳酶解时间为5 h。
温度是影响酶解效率的关键因素。本试验结果表明,类胡萝卜素提取率在酶解温度为50 ℃时达到最高值,而酶解温度继续升高则会导致类胡萝卜素提取率急剧下降。这一现象可从酶的热稳定性角度进行解释:在50 ℃内,复合酶的活性随温度升高而增强,但超过该温度后,酶蛋白可能因高温而发生变性,从而丧失催化能力。此外,过高的温度还可能破坏类胡萝卜素的结构稳定性,这与Zuorro等[19]关于虾青素热敏感性的研究结论相符。因此,本研究最终确定最佳酶解温度为50 ℃。
pH同样是影响酶解效率的关键因素。本试验结果表明,酶解pH为4.5时的类胡萝卜素提取率最高,而偏离该酶解pH后类胡萝卜素提取率显著降低。这一结果与酸性甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶的最适pH范围一致。在pH 4.5的条件下,酶与底物的结合效率最高,酶解反应速率达到最大,从而能够充分降解胶红酵母细胞壁,促进类胡萝卜素的释放。
综上所述,复合酶解法在优化条件下(酶解时间5 h、酶解温度50℃、酶解pH 4.5)能够高效提取胶红酵母类胡萝卜素,为工业化生产提供了可行的技术参考。

3.2 胶红酵母发酵产物对蛋鸡产蛋率及蛋品质的影响

本研究通过28 d的蛋鸡饲喂试验,系统评价了胶红酵母发酵产物作为饲料添加剂对蛋鸡产蛋率及蛋品质的影响。结果表明,在1%~2%的添加剂量范围内,胶红酵母发酵产物能显著提升蛋黄色泽和类胡萝卜素含量,而对产蛋率、蛋壳物理特性及蛋黄比例等核心指标无显著影响。
在蛋壳质量方面,各组蛋壳强度和厚度均未表现出显著差异,且随试验时间的延长呈现自然增强趋势。试验后期(第28天)各组蛋壳强度趋于一致,这可能反映了蛋鸡生理成熟的自然规律。这一现象表明,胶红酵母发酵产物可能主要通过调节肠道菌群改善营养吸收,而非直接参与蛋壳的矿化过程[20]。蛋黄比例在各组间保持相对稳定,且未呈现剂量依赖性,说明该添加剂未改变蛋鸡的脂质代谢模式。值得注意的是,蛋形指数仅在试验初期(第7天)出现短暂差异,后续时间点恢复一致,这可能与蛋鸡的适应过程有关。哈氏指数全程维持在优质水平,且无组间差异,证实胶红酵母发酵产物不影响蛋白的胶体稳定性。这一结果与Nys等[21]提出的蛋白品质主要受储存条件与遗传因素影响理论相符,印证了添加剂对蛋白结构的非干预特性。本试验中,饲喂胶红酵母发酵产物对蛋壳厚度、蛋壳强度等一系列蛋品质指标无显著影响,与Wang等[22]、Yalçin等[23]研究结论一致,说明饲喂胶红酵母发酵产物可以用于蛋鸡饲养,是一种安全放心的饲料添加剂。
在蛋黄色泽方面,添加1%和2%胶红酵母发酵产物的试验组,其蛋黄颜色和类胡萝卜素含量均显著高于对照组。其中,2%胶红酵母发酵产物添加组的类胡萝卜素含量达到44.07 μg/g,较对照组提高了67.1%;蛋黄Roche色度等级提升至13.9,较对照组提高了33.7%。这些数据证实,胶红酵母中的类胡萝卜素能够高效沉积于蛋黄,且呈现剂量依赖性。Akiba等[24]率先开发深红酵母菌剂制备工艺,通过喷雾干燥技术获得类胡萝卜素含量达120 μg/g的酵母细胞干粉,将其作为蛋鸡饲料添加剂应用后发现,饲喂含该菌剂的β-胡萝卜素强化饲粮可显著提升蛋黄比色值。与化学合成色素相比,胶红酵母来源的类胡萝卜素不仅着色效果显著,更具有天然、安全及抗氧化等综合优势[25]。这一发现为开发天然禽蛋着色剂提供了重要依据。

4 结论

① 通过单因素试验和响应面试验对复合酶(甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶)酶解提取胶红酵母类胡萝卜素的工艺条件进行了优化,确定了提取类胡萝卜素的酶解工艺条件为:酶解时间5 h、酶解pH 4.5、酶解温度50 ℃;对类胡萝卜素提取率的影响的大小顺序为:酶解pH>酶解时间>酶解温度。
② 动物试验表明,饲粮中添加1%和2%的胶红酵母发酵产物均能提升蛋黄颜色和类胡萝卜素含量,且对产蛋率、蛋壳物理特性及蛋黄比例等核心指标无显著影响。
③ 综上所述,胶红酵母CS-15固态发酵产物能够安全、高效地改善蛋黄色泽并提升类胡萝卜素含量,为天然饲料添加剂的开发及功能性禽蛋的工业化生产提供了科学依据,具有广阔的应用前景。

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