Chinese Journal of Animal Nutrition >

2026 , Vol. 38 >Issue 5: 3691 - 3701

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.296

RESEARCH PAPER

Regulatory Effects of Selenium on Antioxidant and Anti-Inflammatory Capacities in Donkey Mammary Epithelial Cells and Its Mechanisms

  • MENG Fanzhu ,
  • ZHANG Yue ,
  • ZHAO Yanli ,
  • GUO Yongmei ,
  • GUO Xiaoyu ,
  • ZHANG Qingyue ,
  • YAN Sumei , *
Expand
  • Inner Mongolia University Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science, College of Animal Science, Agricultural University, Hohhot 010018, China
*professor, E-mail:

Received date: 2025-10-31

  Online published: 2026-05-14

Fold

Abstract

This study aimed to investigate the regulatory effects of different concentrations of selenium (Se) on antioxidant capacity, inflammatory response and related signaling pathways in donkey mammary epithelial cells (DMECs), and to screen the optimal concentration for improving the antioxidant and anti-inflammatory capacities of DMECs. A single-factor completely randomized experimental design was adopted. The second-passage DMECs were randomly divided into seven groups with four replicates per group. The culture medium was supplemented with 0 (as control, CON group), 10, 20, 50, 100, 150 and 200 nmol/L (as Se) of selenomethionine, respectively. After 24 h of culture, cell viability, lactoferrin (LTF) content, the activities of antioxidant enzymes and inducible nitric oxide synthase (iNOS), the level of reactive oxygen species (ROS), the contents of nitric oxide (NO) and inflammatory cytokines, as well as the mRNA relative expression levels of LTF, genes related to antioxidant capacity, inflammatory response, and the nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2)/peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ)/nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathways were measured. The results showed that: compared with the CON group, 50 to 200 nmol/L Se significantly increased the activities of total superoxide dismutase (T-SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px), as well as the content of the anti-inflammatory cytokine interleukin-4 (IL-4) (P<0.05); meanwhile, it significantly decreased the contents of the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β), as well as the relative mRNA expression levels of their gene (P<0.05), and significantly inhibited the expression of the key NF-κB signaling factor NF-κB p50 (P<0.05). Se at 10 to 150 nmol/L significantly upregulated the mRNA relative expression level of PPARγ, as well as the content of LTF and its gene mRNA relative expression level (P<0.05). Se at 50 to 150 nmol/L significantly upregulated the mRNA relative expression level of Nrf2 (P<0.05). Se at 50 nmol/L significantly reduced the reactive oxygen species (ROS) level and the mRNA relative expression level of IL-6 (P<0.05). In conclusion, the promoting effects of Se on the viability, antioxidant capacity and anti-inflammatory capacity of DMECs are dose-dependent. The effects are more pronounced at Se concentrations of 50 to 150 nmol/L, with the optimal effect observed at 50 nmol/L, whereas the promoting effect is weakened or even negatively impacted at a high concentration of 200 nmol/L. The mechanism may be associated with the upregulation of LTF, PPARγ and Nrf2 expression, as well as the inhibition of the NF-κB signaling pathway by Se.

Key words： selenium; donkey mammary epithelial cells; antioxidant function; oxidative stress; dose-dependent effect

Cite this article

MENG Fanzhu , ZHANG Yue , ZHAO Yanli , GUO Yongmei , GUO Xiaoyu , ZHANG Qingyue , YAN Sumei . Regulatory Effects of Selenium on Antioxidant and Anti-Inflammatory Capacities in Donkey Mammary Epithelial Cells and Its Mechanisms[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2026 , 38(5) : 3691 -3701 . DOI: 10.12418/CJAN2026.296

驴奶作为一种高营养价值乳品,因富含乳清蛋白、多不饱和脂肪酸及溶菌酶等活性成分,其市场开发日益受到重视[1]。泌乳性能直接决定母畜的经济价值,并有赖于健康的乳腺状态。泌乳高峰期的驴乳腺组织代谢旺盛,易因代谢产物积累和外源刺激产生大量自由基,引发氧化应激[2],该过程会直接损害驴乳腺上皮细胞(DMECs)的结构与功能完整性,进而导致乳产量与乳品质的下降[3-4],造成经济损失。因此,增强DMECs的抗氧化与抗炎能力,是保障驴乳腺健康的关键途径之一。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶在自由基清除过程中发挥重要作用,是反映细胞抗氧化能力的标志性指标[5];白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是反映细胞炎症反应的关键炎症因子[6]。硒(Se)是机体抗氧化防御系统的关键组分,它通过参与GSH-Px等硒蛋白合成,直接清除自由基,从而发挥抗氧化功能,同时,Se还表现出抗炎潜力,能够抑制IL-1β、IL-6和TNF-α等关键炎症因子基因的表达[7]。He等[8]研究发现,Se可显著提高猪乳腺上皮细胞中抗氧化酶GSH-Px、总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性及总抗氧化能力(T-AOC),降低TNF-α与IL-1β等炎症因子的含量。Assabayev等[9]在牛乳腺上皮细胞中也得出了类似结论。本课题组前期通过动物试验发现,饲粮添加Se可通过增强泌乳驴的抗氧化与抗炎能力来提高其产奶量[2],这或与Se对DMECs抗氧化及抗炎能力的调节作用有关。目前,关于Se对牛、猪等哺乳动物乳腺上皮细胞抗氧化和抗炎能力调节作用的研究比较深入。然而,驴的泌乳生理具有乳腺较小且无乳池的独特性[10],Se对DMECs抗氧化、抗炎能力及相关基因表达的调节作用及其剂量依赖性尚不明确。鉴于此,本试验拟通过细胞模型,系统探究Se对DMECs抗氧化与抗炎能力的影响,并初步分析其对核因子E2相关因子2(Nrf2)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)/核因子-κB(NF-κB)等信号通路关键基因表达的调控作用,以期为深入揭示Se调控DMECs抗氧化应激的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验已获得内蒙古农业大学实验动物福利与伦理委员会的许可(批准号:NND2021050)。驴乳腺组织样品无菌采集自内蒙古草原御驴科技牧业有限公司(呼和浩特市)的处于泌乳中期的5岁健康成年母驴,于屠宰后立即取样。

1.2 试剂配制

完全培养基:取100 mL DMEM基础培养基(浙江百迪生物科技有限公司),依次加入10 mL胎牛血清(上海逍鹏生物科技有限公司)、2 mL青-链霉素(双抗,Gibco,美国)、0.5 mL胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS,Gibco,美国),随后加入表皮生长因子(终浓度10 ng/mL,Sigma,美国)、两性霉素B(终浓度2.5 μg/mL,Sigma,美国)和氢化可的松(终浓度1 μg/mL,Sigma,美国),充分混匀后4 ℃保存。
饥饿培养基:除不加胎牛血清及ITS外,其余操作同配制完全培养基。
3 ×双抗杜氏磷酸盐(DPBS)缓冲液:每500 mL DPBS中含3 mL双抗。
1 ×双抗DPBS缓冲液:每500 mL DPBS中含1 mL双抗。
硒代蛋氨酸(SeMet)工作液:将10 mg的SeMet(纯度≥98%,Sigma,美国)溶于100 mL超纯水,配制成500 μmol/L的SeMet原液,试验开始前,取原液加入饥饿培养基,配制成Se浓度分别为0、10、20、50、100、150和200 nmol/L的SeMet工作液。经0.22 μm滤器过滤后,避光冷冻保存。

1.3 DMECs的分离与培养

DMECs的分离与培养参照本课题组已建立的方法[11]进行,即在无菌条件下去除乳腺组织外的筋膜、脂肪及纤维结缔组织,将处理后的组织块放入3×双抗DPBS缓冲液中浸泡10 min左右;用3×双抗DPBS清洗3次,75%乙醇清洗1次,1×双抗DPBS清洗3次,再用眼科剪选取腺泡丰富的部位并剪成糊状;利用Ⅳ型胶原酶消化法获得驴乳腺上皮原代细胞,待原代细胞长到80%~90%时进行传代,并利用细胞角蛋白18免疫荧光染色进行鉴定,证实所得细胞为DMECs,纯度高于90%。

1.4 试验设计

采用单因素完全随机试验设计,将第2代DMECs混匀后随机分为7个组,每组设4个重复。将细胞置于含5%二氧化碳(CO2)的37 ℃培养箱中,使用完全培养基进行培养,待细胞融合度达60%~70%后,更换饥饿培养基培养6 h,随后更换Se浓度分别为0(作为对照,CON组)、10(Se10组)、20(Se20组)、50(Se50组)、100(Se100组)、150(Se150组)和200 nmol/L(Se200组)的SeMet工作液继续培养24 h。Se的处理时间基于本课题组前期对DMECs生长动力学的研究[11]确定。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 细胞活力

采用CCK-8法测定DMECs的细胞活力,结果用相对增殖率(RGR)表示。将DMECs悬液(3×104个/mL)接种于96孔板,按照试验设计加入相应Se浓度的SeMet工作液培养24 h后,每孔加入20 μL的CCK-8溶液(货号:C0039;上海碧云天生物技术股份有限公司),在37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养3 h,使用全自动酶标仪(Spark,TECEN,瑞士)检测各孔450 nm波长处的吸光度(OD450 nm)值,按照如下公式计算RGR:

RGR(%)=(试验组OD450 nm值/

对照组OD450 nm值)×100。

1.5.2 乳铁蛋白含量与抗氧化指标

将DMECs以2×105个/mL的密度接种于6孔板内,按试验设计加入相应Se浓度的SeMet工作液培养24 h后,收集培养液和细胞。细胞内GSH-Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸法(货号:A005-1-2)测定,培养液中T-SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法(货号:A001-1-2)测定,T-AOC采用钼酸铵显色法(货号:A015-2-1)测定,MDA含量采用硫代巴比妥酸法(货号:A003-1-2)测定,上述指标测定所用试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。培养液中CAT活性采用比色法(货号:HY-M0018)测定,乳铁蛋白(LTF)含量采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法(货号:HY-I10047)测定,所用试剂盒购于北京华英生物技术研究所。

1.5.3 氧化应激和炎症反应相关指标

将DMECs以2×105个/mL的密度接种于6孔板内,按试验设计加入相应Se浓度的SeMet工作液培养24 h后,收集培养液。培养液中活性氧(ROS)水平采用化学荧光法(货号:HY-M0087)测定,白细胞介素(IL)-1β(货号:HY-H0001)、IL-2(货号:HY-H0003)、IL-4(货号:HY-H0005)、IL-6(货号:HY-H0007)、IL-10(货号:HY-H0009)、TNF-α含量(货号:HY-H0019)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定,上述指标测定所用试剂盒均购于北京华英生物技术研究所。培养液中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性(货号:A014-1-2)以及一氧化氮(NO)含量(货号:A012-1-2)采用比色法测定,试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.5.4 乳铁蛋白以及抗氧化、炎症反应、Nrf2/PPARγ/NF-κB信号通路相关基因的表达

将DMECs以2×105个/mL的密度接种于6孔板内,按照试验设计加入相应Se浓度的SeMet工作液培养24 h后,采用Trizol法提取细胞内总RNA。使用Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR[货号:11123ES60;翌圣生物科技(上海)股份有限公司]将提取的RNA反转录为cDNA,操作按试剂盒说明书进行。在实时荧光定量PCR仪(LightCycler 480 Ⅱ,Roche,瑞士)上使用Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix[货号:11201ES08;翌圣生物科技(上海)股份有限公司]测定细胞内目的基因的表达水平,详细步骤参照试剂盒说明书。PCR所用引物序列见表1,引物通过Primer 5.0软件设计,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、酪氨酸3-单氧合酶(YWHAZ)、β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因,先对3个内参基因的Ct值取几何平均值,再采用2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA相对表达量。
表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因名称
Gene names		 GenBank登录号
GenBank
accession No.		 引物序列
Primer sequences (5'—3')		 产物长度
Product
length/bp
磷酸甘油醛脱氢酶
GAPDH		 NM_001163856.1 F:GATGCCCCAATGTTTGTGA
R:AAGCAGGGATGATGTTCTGG		 250
酪氨酸3-单加氧酶
YWHAZ		 AY970970 F:TGTAGGAGCCCGTAGGTCATCT
R:TTCTCTCTGTATTCTCGAGCCATCT		 102
β-肌动蛋白
β-actin		 U39357 F:ACTGGGACGACATGGAGAAGA
R:GCGTACAGGGACAGCACAG		 199
谷胱甘肽过氧化物酶1
GPx1		 NM_001166479.1 F:CAGTTCGGGCATCAGGAGAAC
R:CACCTCGCACTTCTCAAAGAG		 114
谷胱甘肽过氧化物酶4
GPx4		 XM_023644325.1 F:CGATACGCTGAGTGCGGTTTA
R:AGCCGTTCTTGTCGATGAGGA		 259
乳铁蛋白
LTF		 NM_001163974.1 F:CATACTTTGGCTACTCTGGTGC
R:ACGCCGATGACTTGTTTCT		 294
过氧化氢酶
CAT		 XM_014729341.2 F:TCAACAGTGCCAACGAGGACAAC
R:AGTTCTTGACCGCTTTCTTCTGGATG		 150
超氧化物歧化酶1
SOD1		 NM_001081826.3 F:GCGTCTTCTGCTGCGTCTGT
R:TGGAATCCGTGATCGCCTTT		 200
超氧化物歧化酶2
SOD2		 NM_001082517.2 F:CGATCTCCGAGGTGCTTTGC
R:ATCTGGGCGTTGATGTAGGG		 173
肿瘤坏死因子-α
TNF-α		 NM_001081819.2 F:AGCCTCTTCTCCTTCCTCCTTGTC
R:CATTCGGTAACTGCTCTTCCCTCTG		 100
白细胞介素-6
IL-6		 AF041975 F:TCAAGGGTGAAAAGGAAAACATC
R:GGTGGTTACTTCTGGATTCTTC		 98
白细胞介素-1β
IL-1β		 NM_001082526 F:AGCGGCAATGAGAATGACCTGTTC
R:GTTGTAGAGGTGGTGGGAGAATTGAAG		 132
核因子-κB p50
NF-κB p50		 XM_005608589.3 F:GGCAGAAGGCGGAGGAGACC
R:CATGAGTCGCACCACGCTGAG		 109
核因子-κB p65
NF-κB p65		 XM_023654462.1 F:CTGCATCCACAGCTTCCAGAACC
R:CATAGCCGCACCGCATTCAGG		 156
核因子E2相关因子2
Nrf2		 XM_023622057.1 F:CAACTCAGCACCTTGTATCTCG
R:CGTCTGTCTTCCTGCTCTTGG		 139
过氧化物酶体增殖物激活受体γ
PPARγ		 XM_023619951.1 F:CCACTGACCAAAGCGAAGG
R:CCCTGAAAGATGCGGATGG		 173

1.6 数据统计与分析

试验数据利用Excel 2021进行整理后,使用SAS 8.1软件的GLM程序和回归分析(线性和二次效应)程序进行分析,并采用Duncan氏法进行多重比较评估组间差异,以P<0.05表示组间差异显著或回归分析显著。

2 结果与分析

2.1 Se浓度对细胞活力、乳铁蛋白含量与抗氧化指标的影响

由表2可知,各Se处理组的RGR均显著高于CON组(P<0.05),其中以Se50、Se100、Se150组较高,尤以Se50组最高;与CON组相比,各Se处理组的LTF含量和CAT活性均显著升高(P<0.05),其中CAT活性以Se100~Se200组较高,显著高于其他Se处理组(P<0.05),尤以Se200组最高;Se50~Se200组的T-SOD和GSH-Px活性均显著高于CON组(P<0.05),其中以Se50和Se100组较高;Se100、Se150和Se200组的T-AOC显著高于CON组(P<0.05),尤以Se200组较高;各组间MDA含量无显著差异(P>0.05)。回归分析结果显示,随着Se浓度的增加,RGR、T-AOC、LTF含量及CAT活性和T-SOD活性均呈显著的线性(P<0.05)或二次曲线(P<0.05)升高,GSH-Px活性呈显著的二次曲线(P<0.05)升高。
表2 Se浓度对细胞活力(以相对增殖率表示)、乳铁蛋白含量与抗氧化指标的影响

Table 2 Effects of Se concentration on cell viability (expressed as RGR), lactoferrin content and antioxidant parameters

项目
Items		 组别 Groups 均值
标准误
SEM		 P值 P-value 决定系数 R2
CON Se10 Se20 Se50 Se100 Se150 Se200 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic		 线性
Linear		 二次
Quadratic
相对增殖率 RGR/% 100.00c 106.06b 106.71b 111.56a 108.52ab 108.03ab 107.18b 1.189 <0.001 0.038 <0.001 0.077 0.289
乳铁蛋白 LTF/(μg/mL) 0.03b 0.04a 0.04a 0.04a 0.04a 0.04a 0.04a 0.001 <0.001 0.001 <0.001 0.373 0.506
过氧化氢酶 CAT/(U/mL) 4.26d 5.12c 5.14c 5.17c 5.48b 5.54b 5.82a 0.065 <0.001 0.006 <0.001 0.256 0.430
谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px/(U/mg prot)		 14.53c 17.22bc 18.78bc 31.66a 30.46a 22.48b 22.84b 2.185 <0.001 0.089 <0.001 0.107 0.495
总超氧化物歧化酶
T-SOD/(U/mL)		 2.65d 2.67d 2.64d 2.96ab 3.05a 2.88bc 2.81c 0.046 <0.001 0.018 <0.001 0.196 0.639
总抗氧化能力 T-AOC/(mmol/L) 0.41c 0.41c 0.42bc 0.42bc 0.43ab 0.43ab 0.45a 0.007 0.005 <0.001 <0.001 0.518 0.518
丙二醛 MDA/(nmol/mL) 1.65 1.58 1.57 1.55 1.59 1.61 1.62 0.030 0.316 0.544 0.293 0.014 0.094

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while the same or no letter superscript mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 Se浓度对氧化应激和炎症反应相关指标的影响

由表3可知,与CON组相比,Se10、Se20、Se100、Se150组ROS水平无显著变化(P>0.05),但Se50组显著降低(P<0.05),而Se200组则显著升高(P<0.05);与CON组相比,各Se处理组的IL-6和IL-1β含量均显著降低(P<0.05),其中IL-1β含量以Se100、Se200组较低,显著低于其他Se处理组(P<0.05),IL-6含量以Se20~Se150组较低,Se200组最低;Se20~Se200组的TNF-α和IL-2含量均显著低于CON组(P<0.05),尤以Se200组最低,显著低于其他Se处理组(P<0.05);Se50~Se200组的IL-4含量显著高于CON组(P<0.05),其中以Se200组最高;Se100、Se150和Se200组的IL-10含量显著高于CON组(P<0.05),其中以Se200组最高;各组间NO含量和iNOS活性无显著差异(P>0.05)。回归分析结果显示,随着Se浓度的增加,ROS水平呈显著的二次曲线(P<0.05)降低,IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-2含量均呈显著的线性(P<0.05)或二次曲线(P<0.05)降低,IL-4和IL-10含量呈显著的线性(P<0.05)或二次曲线(P<0.05)升高。
表3 Se浓度对氧化应激和炎症反应相关指标的影响

Table 3 Effects of Se concentration on oxidative stress and inflammatory response-related indicators

项目
Items		 组别 Groups 均值
标准误
SEM		 P值 P-value 决定系数 R2
CON Se10 Se20 Se50 Se100 Se150 Se200 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic		 线性
Linear		 二次
Quadratic
活性氧 ROS/(荧光强度/mL) 88.57bc 89.07bc 90.74ab 84.07d 87.06c 87.93c 92.26a 0.920 <0.001 0.214 <0.001 0.059 0.479
一氧化氮 NO/(μmol/L) 18.93 18.36 18.93 17.43 17.77 18.60 18.27 2.844 0.997 0.882 0.941 0.001 0.005
诱导型一氧化氮合酶
iNOS/(U/mL)		 1.68 1.67 1.69 1.68 1.54 1.70 1.68 0.018 0.372 0.850 0.386 0.001 0.048
肿瘤坏死因子-α
TNF-α/(pg/mL)		 17.60a 16.63ab 15.71bc 15.49c 15.17cd 14.25d 12.22e 0.332 <0.001 <0.001 <0.001 0.794 0.797
白细胞介素-1β IL-1β/(pg/mL) 13.64a 10.80b 10.54b 10.13b 10.11b 9.29c 8.76c 0.268 <0.001 <0.001 <0.001 0.559 0.618
白细胞介素-6 IL-6/(pg/mL) 39.23a 32.40b 31.68bc 31.57bc 31.02bc 30.75bc 30.09c 0.649 <0.001 0.001 <0.001 0.343 0.464
白细胞介素-2 IL-2/(pg/mL) 43.26a 43.12a 40.36b 38.06c 38.01c 35.99d 32.61e 0.364 <0.001 <0.001 <0.001 0.882 0.887
白细胞介素-4 IL-4/(pg/mL) 3.95c 4.17bc 4.22bc 4.39ab 4.47ab 4.55ab 4.66a 0.130 0.013 <0.001 <0.001 0.434 0.468
白细胞介素-10 IL-10/(pg/mL) 5.70d 6.07cd 6.24bcd 6.37bcd 6.59bc 6.95ab 7.40a 0.239 0.001 <0.001 <0.001 0.586 0.586

2.3 Se浓度对乳铁蛋白与抗氧化相关基因mRNA相对表达量的影响

由表4可知,与CON组相比,Se10~Se200组谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)的mRNA相对表达量均显著升高(P<0.05),其中GPx1的mRNA相对表达量以Se50~Se150组较高,尤以Se100组最高,GPx4的mRNA相对表达量以Se20~Se100组较高,尤以Se100组最高;超氧化物歧化酶2(SOD2)的mRNA相对表达量呈现与GPx1和GPx4相似的规律;Se10~Se150组LTF的mRNA相对表达量均显著高于CON组(P<0.05),并以Se10~Se50组较高,显著高于其他Se处理组(P<0.05);各组间SOD1和CAT的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。回归分析结果显示,随着Se浓度的增加,GPx1的mRNA相对表达量呈显著的线性(P<0.05)或二次曲线(P<0.05)升高,GPx4、LTF的mRNA相对表达量均呈显著的二次曲线(P<0.05)升高。
表4 Se浓度对乳铁蛋白与抗氧化相关基因mRNA相对表达量的影响

Table 4 Effects of Se concentration on mRNA relative expression levels of LTF and antioxidant-related genes

项目
Items		 组别 Groups 均值
标准误
SEM		 P值 P-value 决定系数 R2
CON Se10 Se20 Se50 Se100 Se150 Se200 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic		 线性
Linear		 二次
Quadratic
乳铁蛋白 LTF 1.00d 1.82b 2.26a 1.90b 1.48c 1.34c 1.02d 0.092 <0.001 0.075 0.023 0.150 0.327
谷胱甘肽过氧化物酶1 GPx1 1.00f 1.26e 1.47cd 1.64b 1.96a 1.60bc 1.44d 0.045 <0.001 0.022 <0.001 0.187 0.812
谷胱甘肽过氧化物酶4 GPx4 1.00e 1.26cd 1.39abc 1.40ab 1.46a 1.30bcd 1.22d 0.043 <0.001 0.446 <0.001 0.023 0.484
超氧化物歧化酶1 SOD1 1.00 1.04 1.19 1.06 1.02 1.01 1.01 0.063 0.392 0.302 0.573 0.041 0.044
超氧化物歧化酶2 SOD2 1.00b 1.97a 2.02a 1.92a 1.95a 1.66a 1.66a 0.141 0.001 0.634 0.114 0.011 0.187
过氧化氢酶 CAT 1.00 1.29 1.42 1.43 1.38 2.03 1.27 0.446 0.813 0.357 0.452 0.036 0.067

2.4 Se浓度对炎症反应、Nrf2/PPARγ/NF-κB信号通路相关基因mRNA相对表达量的影响

由表5可知,各Se处理组IL-1β的mRNA相对表达量均显著低于CON组(P<0.05);Se50组IL-6的mRNA相对表达量显著低于CON组(P<0.05),其他Se处理组与CON组相比无显著差异(P>0.05);与CON组相比,NF-κB p50的mRNA相对表达量在Se20~Se200组均显著降低(P<0.05),而NF-κB p65的mRNA相对表达量仅在Se100组显著降低(P<0.05);Se10~Se150组PPARγ的mRNA相对表达量均显著高于CON组(P<0.05),以Se50~Se150组较高,尤以Se150组最高;Se10~Se150组Nrf2的mRNA相对表达量均显著高于CON组(P<0.05),其中以Se50~Se150组较高,尤以Se100组最高;TNF-α的mRNA相对表达量均无显著差异(P>0.05)。回归分析结果显示,随着Se浓度的增加,IL-1β、TNF-α、NF-κB p65和NF-κB p50的mRNA相对表达量均呈显著的线性(P<0.05)或二次曲线(P<0.05)降低,PPARγ和Nrf2的mRNA相对表达量呈显著的二次曲线(P<0.05)升高。
表5 Se浓度对炎症反应、Nrf2/PPARγ/NF-κB信号通路相关基因mRNA相对表达量的影响

Table 5 Effects of Se concentration on mRNA relative expression levels of inflammatory response and Nrf2/PPARγ/NF-κB signaling pathway-related genes

项目
Items		 组别 Groups 均值
标准误
SEM		 P值 P-value 决定系数 R2
CON Se10 Se20 Se50 Se100 Se150 Se200 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic		 线性
Linear		 二次
Quadratic
白细胞介素-1β IL-1β 1.00a 0.40b 0.41b 0.37b 0.31b 0.21b 0.27b 0.057 <0.001 0.004 0.001 0.340 0.499
白细胞介素-6 IL-6 1.00a 0.89a 0.91a 0.72b 0.87ab 0.95a 0.94a 0.055 0.044 0.682 0.128 0.007 0.152
肿瘤坏死因子-α TNF-α 1.00 1.25 1.09 0.91 0.87 0.98 0.71 0.106 0.052 0.008 0.032 0.241 0.241
核因子-κB p65 NF-κB p65 1.00ab 1.14a 1.13a 1.12a 0.76c 0.85bc 0.91bc 0.096 0.012 0.004 0.006 0.277 0.339
核因子-κB p50 NF-κB p50 1.00a 0.82ab 0.71b 0.71b 0.67b 0.69b 0.66b 0.065 0.023 0.013 0.010 0.238 0.343
过氧化物酶体增殖物激活受体γ
PPARγ		 1.00f 1.23e 1.38d 1.73c 2.74b 2.97a 0.99f 0.039 <0.001 0.067 <0.001 0.123 0.835
核因子E2相关因子2 Nrf2 1.00d 1.15bc 1.11bcd 1.18b 1.34a 1.23ab 1.04cd 0.043 <0.001 0.652 0.001 0.008 0.419

3 讨论

与牛乳相比,驴乳具有低乳脂、高乳糖和高乳清蛋白的特点,但其乳腺生理结构较为独特,体积小且无乳池[10]。在泌乳期,乳腺组织的高代谢状态易引起ROS等自由基激增,诱发氧化应激,进而损伤乳腺组织并降低产奶量[12]。乳腺上皮细胞作为合成乳成分的主要场所,增强其抗氧化和抗炎能力是提高泌乳性能的关键。GSH-Px、SOD、CAT和T-AOC是评估抗氧化功能的重要指标[13]。Se是机体抗氧化防御的关键组分,它通过参与GSH-Px等硒蛋白合成,直接清除自由基,发挥抗氧化功能[14-15]。目前关于Se调控乳腺上皮细胞抗氧化及抗炎能力的研究多集中于奶牛、猪等动物,对DMECs的影响尚未见报道。本研究发现,50~150 nmol/L的Se可显著提高体外培养的DMECs中GSH-Px、T-SOD、CAT活性及T-AOC;而当浓度升至200 nmol/L时,GSH-Px和T-SOD活性有所降低,表明Se对DMECs抗氧化能力的促进作用呈剂量依赖性,过高剂量反而会降低细胞的抗氧化功能。本课题组前期的体内研究同样发现,饲粮中的Se可剂量依赖性地增强泌乳驴的抗氧化与抗炎能力[2]。作为乳腺组织的主要功能细胞,Se对DMECs的影响可部分解释Se对泌乳驴体内抗氧化与抗炎能力的促进作用,这为相关机制研究提供了重要思路。然而,体外模型难以完全模拟体内的复杂调控环境,且细胞培养液与血液中的Se浓度存在差异,故其结论在指导生产实践时存在局限性,仍需进一步研究。
IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子是细胞发生炎症反应的标志物[16]。本研究结果显示,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量随Se浓度的增加呈剂量依赖性下降,其中以20~200 nmol/L的Se的降低效果较好,并在Se浓度为200 nmol/L达到最低;相反,抗炎细胞因子IL-4和IL-10以及LTF含量则随Se浓度的增加呈剂量依赖性上升,其中以50~200 nmol/L的Se促进效果较好。这表明Se在改善DMECs抗氧化能力的同时,还能有效重塑细胞的炎症平衡,并且对促炎细胞因子的产生具有剂量依赖性抑制作用。此外,本研究还发现,Se对DMECs中ROS水平的影响也呈典型的剂量依赖性,50 nmol/L的Se通过GSH-Px等抗氧化酶发挥抗氧化作用,有效清除了ROS;但当Se浓度超过100 nmol/L时,则诱发促氧化反应,导致ROS水平回升。Yang等[17]在BMECs中的研究也证实Se能够有效降低ROS水平,与本研究结果一致。值得注意的是,尽管超过100 nmol/L的Se引起ROS水平上升,但脂质过氧化终产物MDA的含量在各组间均未出现显著差异,提示Se可能通过增强DMECs内抗氧化防御体系,将氧化损伤控制在自由基阶段,从而阻断了脂质过氧化反应的进一步发展。同时,NO的含量及其合成关键酶iNOS的活性未发生显著变化。这与本课题组成员前期所得结果[18]一致,即Se对正常BMECs中的NO生成及iNOS信号通路无显著影响,但在氧化应激或炎症条件下,Se能够有效逆转细胞损伤所引发的NO过量生成。
关于Se对DMECs抗氧化功能与炎症反应的调控机制尚不明确。在抗氧化方面,Nrf2作为调控细胞氧化应激反应的关键转录因子[19],可靶向调节GSH-Px、SOD和血红素加氧酶-1(HO-1)等多种抗氧化酶的基因表达,对于维持机体氧化还原平衡至关重要[15]。本研究发现,Se对Nrf2及其下游靶基因GPx1、GPx4、SOD2的mRNA表达的促进作用呈二次曲线剂量依赖性,其中以50~150 nmol/L Se的促进效果较好,这说明激活Nrf2信号通路是Se增强DMECs抗氧化能力的关键分子机制,这与Ma等[20]在BMECs上所得结果一致。值得注意的是,Se对LTF表达的调控呈现与Nrf2一致的二次曲线剂量依赖关系。LTF作为一种多功能糖蛋白,不仅能直接清除ROS及螯合三价铁离子(Fe3+),还能激活Nrf2信号通路[21-22],这提示LTF可能是Se激活Nrf2信号通路的上游关键因子。PPARγ可负向调控NF-κB信号通路[23-24],LTF也被报道可抑制NF-κB信号通路[25]。本研究发现,20~150 nmol/L的Se可剂量依赖性地激活PPARγ,上调LTF的表达,抑制NF-κB p50的表达,说明Se可能通过协同调控LTF与PPARγ,抑制NF-κB信号通路,从而发挥抗炎作用。本课题组前期体内试验得出,饲粮中的Se对泌乳驴抗氧化与抗炎的促进效果呈剂量依赖性[2]。本研究进一步在细胞层面验证了Se对DMECs抗氧化与抗炎作用的剂量效应。综上所述,适宜浓度的Se可通过协同调控Nrf2/LTF与PPARγ/NF-κB信号通路,增强DMECs的抗氧化与抗炎能力,这为阐明Se在维持泌乳驴乳腺健康中的作用提供了新的理论依据。然而,其具体分子机制仍有待深入解析,后续研究应进一步探索Se在氧化应激条件下对线粒体功能及细胞凋亡通路的调控机制,以更全面地揭示其保护效应。

4 结论

Se对DMECs活力、抗氧化及抗炎能力均表现出剂量依赖性促进作用,Se浓度在50~150 nmol/L时效果显著且以浓度为50 nmol/L时效果最好,而浓度升至200 nmol/L时促进作用减弱,甚至产生负面影响,其作用机制与Se上调LTF、PPARγ和Nrf2表达并抑制NF-κB信号通路有关。

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