Chinese Journal of Animal Nutrition >

2026 , Vol. 38 >Issue 5: 3779 - 3794

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.302

RESEARCH PAPER

Evaluation of Environmental Tolerance of Coated Bacillus velezensis PB3 and Its Effects on Growth and Intestinal Microbiota of Mice

  • WANG Jiaying , 1, 2, 3 ,
  • LIU Yuchun 1, 2, 3 ,
  • XIA Zihan 1, 2, 3 ,
  • CAO Yang , 1, 2, 3, 4, 5, * ,
  • ZANG Yanqing , 6, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China
  • 2 Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Efficient Utilization of Feed Resources and Nutrition Manipulation in Cold Region, Daqing 163319, China
  • 3 Engineering Technology Research Center of Daqing Biological Feed Development and Safe Utilization, Daqing 163319, China
  • 4 Engineering Research Center of Processing and Utilization of Grain By-Products, Ministry of Education, Daqing 163319, China
  • 5 Key Laboratory of Low-Carbon Green Agriculture in Northeastern China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Daqing 163319, China
  • 6 College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China
*CAO Yang, professor, E-mail: ;
ZANG Yanqing, associate professor, E-mail:

Received date: 2025-10-18

  Online published: 2026-05-14

Fold

Abstract

This study aimed to investigate the environmental tolerance of coated Bacillus velezensis PB3 and its effects on growth and intestinal microbiota of mice. First, using a metal-phenolic-prebiotic composite technology, Fe3+-tannic acid-β-glucan (FTG)-coated Bacillus velezensis PB3 (FTG-PB3) was constructed with ferric chloride (FeCl3) solution, tannic acid solution and β-glucan solution. The growth activity, antibacterial activity, and tolerance to temperature, acid and bile salts of the strain PB3 were determined before and after coating. Subsequently, a mouse feeding trial was conducted with FTG-PB3. Mice in the control group were gavaged with 0.2 mL of LB nutrient broth daily, while those in the FTG-PB3 group received 0.2 mL of FTG-PB3 bacterial suspension (1×1010 CFU/mL) daily. After 28 consecutive days of gavage, the relative indexes of growth performance, serum inflammatory factor contents, intestinal morphology and intestinal microbiota structure of the mice were assessed. The results showed as follows: 1) when the concentrations of the coating materials, namely FeCl3 solution, tannic acid solution and β-glucan solution, were 10, 10 and 0.4 mg/mL, respectively, the constructed FTG-PB3 exhibited the smallest particle size and the Zeta potential reached its peak value. Scanning electron microscopy revealed that the surface of FTG-PB3 was rough and wrinkled. 2) The 12-h survival rate of FTG-PB3 was not significantly different from that of the original strain PB3 (P>0.05), and its antibacterial activity also showed no significant difference compared with PB3 (P>0.05). Under different temperature conditions, the relative survival rate of FTG-PB3 was not significantly different from that of PB3 (P>0.05); however, under different pH and bile salt concentrations, the relative survival rate of FTG-PB3 was significantly higher than that of PB3 (P<0.05). 3) Compared with the control group, final body weight and average daily gain were significantly increased of the FTG-PB3 group (P<0.05); ileal villus height and villus height/crypt depth ratio were significantly increased (P<0.05), crypt depth was significantly decreased (P<0.05), and colon length was significantly increased of the FTG-PB3 group (P<0.05); serum contents of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 were significantly decreased (P<0.05), while interleukin-10 content was significantly increased of the FTG-PB3 group (P<0.05). 4) Compared with the control group, FTG-PB3 increased the relative abundances of beneficial bacteria and decreased the relative abundances of harmful bacteria in the intestinal microbiota of mice. In conclusion, the FTG coating material does not affect the growth activity and antibacterial activity of PB3, but can enhance its resistance to extreme environments. FTG-PB3 can promote growth, ensure normal intestinal development, regulate gut microbiota composition, and maintain intestinal health in mice.

Key words： coating; Bacillus velezensis PB3; environmental tolerance; mice; intestinal microbiota

Cite this article

WANG Jiaying , LIU Yuchun , XIA Zihan , CAO Yang , ZANG Yanqing . Evaluation of Environmental Tolerance of Coated Bacillus velezensis PB3 and Its Effects on Growth and Intestinal Microbiota of Mice[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2026 , 38(5) : 3779 -3794 . DOI: 10.12418/CJAN2026.302

益生菌是一类对宿主健康有益的活性微生物,足量摄入后能够促进营养物质的消化与吸收,并维持肠道菌群的结构平衡。当前,如何减轻益生菌在喷雾干燥过程及胃肠道环境中受到的恶劣条件损害,已成为研究关注的重点之一。常见的饲用益生菌包括乳酸菌、双歧杆菌和芽孢杆菌等[1]。芽孢杆菌具有兼性厌氧、耐高温、生长速度快以及对胃肠道环境适应性强的特点,使其在饲料加工和体内环境下更易存活,从而弥补了乳酸菌等在加工过程中对温度敏感、严格厌氧、生长缓慢等不足,有效解决了规模化生产与厌氧处理困难的问题[2-3]。性能优良的芽孢杆菌能够刺激机体免疫系统,缓解肠道疾病,已被广泛用于改善肠道健康[1]。其中,贝莱斯芽孢杆菌可产生多种消化酶和抗菌活性物质,能够显著提高动物的生长性能与免疫力,提升肠道中短链脂肪酸和乳酸的含量[4]。此外,该菌还具有促进肠道有益微生物生长、调节肠道菌群结构、增强肠道稳态的作用[5]。因此,贝莱斯芽孢杆菌在动物健康养殖中展现出广阔的应用前景。
益生菌在宿主体内有效发挥功能,需满足高存活率与高效肠道定植2个前提条件。然而,胃液与胆汁的存在使芽孢杆菌孢子在胃内的存活与萌发面临困难[6];进入肠道后,孢子仅能在近端萌发并有限生长[7]。为增强益生菌在胃肠道恶劣环境中的存活能力,亟需开发简便高效的保护策略。金属-酚醛-益生元复合技术为克服这一限制提供了有效手段,通过基于益生元的Fe3+-单宁酸-β-葡聚糖(Fe3+-tannic acid-β-glucan,FTG)的包被层在益生菌表面形成动态物理屏障,可抵御胃酸与胆盐的侵害,同时不抑制菌体活性,构成“益生菌纳米装甲”[8-9]。该安全可食用的纳米包被层可增强益生菌体内生存能力[8],这启发我们将其应用于益生菌胃肠道耐受性的保护研究。本团队前期从健康仔猪新鲜粪便中分离筛选出1株抑菌效果良好的贝莱斯芽孢杆菌PB3(Bacillus velezensis PB3),本试验拟对该菌株构建FTG包被层,并系统评价FTG包被贝莱斯芽孢杆菌PB3(FTG-PB3)的体外耐受性,在此基础上进一步探究该包被菌株对健康小鼠生长性能及肠道菌群的影响,以期为猪源益生性芽孢杆菌的开发与应用提供参考依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源

试验用贝莱斯芽孢杆菌PB3是本团队前期从随机采取的18头健康仔猪新鲜粪便样品中分离获得,保藏于黑龙江寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室。

1.1.2 主要试剂及供试小鼠

LB营养肉汤购自青岛海博生物技术有限公司;革兰氏染色液、牛胆盐购自北京索莱宝科技有限公司;单宁酸(分析纯)购自山东科源生化有限公司;β-葡聚糖(纯度为85%)购自上海麦克林生化科技有限公司;无水三氯化铁(FeCl3)(分析纯)购自辽宁泉瑞试剂有限公司。
试验小鼠为无特定病原体(SPF)级8周龄雄性BALB/c小鼠,购自辽宁长生生物技术股份有限公司;小鼠维持饲粮购自辽宁长生生物技术股份有限公司,该饲粮符合GB/T 14924.1—2001、GB/T 14924.2—2001及GB 14924.3—2010的要求。

1.2 试验方法

1.2.1 FTG包被系统的构建

单宁酸溶液浓度的确定:取LB营养肉汤中过夜培养的PB3菌液5 mL,离心(4 ℃、1 000×g、5 min)后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次[9];将细菌重悬于1 mL PBS中制备菌悬液,向100 μL菌悬液中加入20 μL浓度为10 mg/mL的FeCl3溶液,振荡1 min,随后加入20 μL不同浓度(0、10、20、30、40 mg/mL)的单宁酸溶液,振荡1 min后,使其在PB3表面形成牢固的铁-单宁酸(FT)层,构成FT-PB3;1 000×g离心5 min,用PBS洗涤2次,除去未反应的单宁酸和铁离子,收集FT-PB3测定粒径。每个浓度设3个重复。
β-葡聚糖溶液浓度的确定:按上述方法构成FT-PB3后,向FT-PB3中加入20 μL不同浓度(0、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL)的β-葡聚糖溶液,振荡1 min,形成FTG包被层,构成FTG-PB3,1 000×g离心5 min,PBS洗涤2次后收集FTG-PB3测定Zeta电位,最后使用电子显微镜观察菌株形态。每个浓度设3个重复。

1.2.2 FTG包被层对PB3生长活性的影响

取PB3菌液,按1%的比例接种于LB营养肉汤中过夜培养,然后分为4组进行不同处理。PB3组:向2 mL PB3菌液中加入2 mL无菌LB营养肉汤;FT-PB3组:向2 mL PB3菌液中加入含20 μL FeCl3溶液(10 mg/mL)、20 μL单宁酸溶液(10 mg/mL)的2 mL无菌LB营养肉汤;G-PB3组:向2 mL PB3菌液中加入含20 μL的β-葡聚糖溶液(0.4 mg/mL)的2 mL无菌LB营养肉汤;FTG-PB3组:向2 mL PB3菌液中加入含20 μL FeCl3溶液(10 mg/mL)、20 μL单宁酸溶液(10 mg/mL)和20 μL β-葡聚糖溶液(0.4 mg/mL)的2 mL无菌营养肉汤。4组均在37 ℃培养12 h后测定其在600 nm下的吸光度(OD600 nm),以PB3菌液作为对照,计算菌株的相对存活率。每组设3个重复。

1.2.3 FTG包被层对PB3抑菌活性的影响

采用牛津杯琼脂扩散法以产肠毒素大肠杆菌ATCC 25922为指示菌,测定FTG-PB3、PB3以及包被层FTG的抑菌活性。将含有指示菌的培养基倒入平皿中,凝固后放置牛津杯,向牛津杯内分别加入FTG-PB3、PB3的无细胞上清液以及FTG,置于培养箱37 ℃培养24 h后,使用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.3 PB3与FTG-PB3的益生性能评估

1.3.1 耐温试验

取PB3菌液以1%接种量接种于LB营养肉汤中,37 ℃培养24 h后取2 mL菌液,向菌液中加入20 μL FeCl3溶液(10 mg/mL)振荡1 min,再加入20 μL单宁酸溶液(10 mg/mL)振荡1 min,最后加入20 μL β-葡聚糖溶液(0.4 mg/mL)振荡1 min,并洗涤2次,加入4 mL未经处理的LB营养肉汤构成FTG-PB3菌液。将FTG-PB3菌液以及PB3菌液分别置于结果中为20、40、60 ℃的水浴锅中水浴30 min后,37 ℃培养12 h后测定其OD600 nm。PB3菌液以无菌LB营养肉汤为对照,FTG-PB3菌液以PB3菌液为对照,计算菌株的相对存活率。每个温度下每个处理设3个重复。

1.3.2 耐酸和耐胆盐试验

按1.3.1中方法取PB3菌液并构成FTG-PB3菌液,将FTG-PB3菌液以及PB3菌液分别置于4 mL含有不同pH(分别为3、4、5)或不同浓度(0.2%、0.4%、0.6%)胆盐的LB营养肉汤中,37 ℃培养12 h后测定其OD600 nm。PB3菌液以无菌LB营养肉汤为对照,FTG-PB3菌液以PB3菌液为对照,计算菌株相对存活率,每组3个重复。

1.4 小鼠试验

将SPF级8周龄雄性BALB/c小鼠在鼠房中适应性饲养7 d后,选取体重约21 g的健康小鼠12只,随机分为2组,每组6只(n=6)。对照组每日灌胃0.2 mL LB营养肉汤,FTG-PB3组每日灌胃0.2 mL浓度为1×1010 CFU/mL的FTG-PB3菌液,连续灌胃28 d。整个试验期内,小鼠单笼饲养,统一饲喂小鼠维持饲粮,光照周期为12 h光照/12 h黑暗(08:00—20:00光照),环境温度为(21±2) ℃。小鼠试验方案已经黑龙江八一农垦大学动物科技学院委员会批准(批准号:DWKJXY2023131),试验过程严格按照美国国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK54050)实行。

1.4.1 生长性能测定

正式试验第1天(初始)和第28天(终末)称量小鼠体重(禁食不禁水12 h),分别作为初始体重、终末体重,并记录每日的采食量,计算小鼠的平均日增重、平均日采食量及料重比(平均日采食量/平均日增重)。

1.4.2 血清免疫因子含量测定

经腹腔注射50 mg/kg BW的戊巴比妥钠将小鼠麻醉,之后在腹主动脉抽取血液,1 000×g离心5 min后收集血清,使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海森兴研生物技术有限公司)测定白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-22(IL-22)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,一切操作程序严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 肠道组织形态观察

将采血后的小鼠麻醉后处死,取回肠组织于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后取出,并按照脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋等步骤制作切片。对切片进行苏木精-伊红(HE)染色,利用光学显微镜对肠道组织形态进行观察,每组选取5张切片,对绒毛和隐窝区域进行50倍成像,借助ImageJ软件测量绒毛高度、隐窝深度,计算绒毛高度/隐窝深度比值。取完整的结肠,测定结肠长度。

1.4.4 肠道菌群分析

用无菌手术器械迅速采集盲肠内容物,置于无菌冻存管中,编号后迅速放入液氮罐中冻存,送至杭州开泰生物技术有限公司进行肠道菌群分析。具体步骤如下:取0.2 g左右小鼠盲肠内容物使用BayBiopure STNM-64试剂盒(广州湾区生物科技有限公司)严格按照说明书提取总DNA,然后采用特异性引物进行PCR扩增,PCR扩增产物由AMPure XP Beads(贝克曼库尔特有限公司)纯化,Qubit Fluorometer(赛默飞世尔科技公司)定量;采用Qsep100全自动核酸蛋白分析仪(广州吉源生物科技有限公司)和文库定量试剂盒KAPA Library Quantification Kit(默克生命科学有限公司)对纯化后的PCR产物进行评估,合格的样本使用Illumina Novaseq 6000 PE250测序平台进行双端测序。
测序完成后,所有数据均在开泰生物云平台(https://kaitai.cloud/tools)进行分析。首先,使用cutadapt(v2.4)软件对双端原始数据进行质控,随后通过QIIME2(v2023.9)的dada2 denoise-paired命令进行去噪,获得有效数据。基于Qiime2的DADA2管道命令,获取每个样本中的扩增子序列变体(ASV)的丰度信息,并以测序样本中最少reads数为基数进行统一抽平。使用Qiime2的feature-classifier命令,将ASV代表序列与数据库进行比对,为每个ASV序列匹配相似度最高的物种信息,完成分类学注释;基于Wilcoxon秩和检验进行α多样性组间差异分析;基于β多样性分析,评估各组间微生物群落结构的组成差异,结果以主坐标分析(PCoA)图和非度量多维尺度分析(NMDS)图呈现;此外,利用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)分析鉴定从门至属水平上相对丰度在不同组间存在显著差异的细菌类群。

1.5 数据分析

采用SPSS 28.0软件对试验数据进行统计分析,GraphPad Prism 10软件作图,试验结果以“平均值±标准差”形式表示。对包被系统构建及菌株活性测定结果进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并应用Duncan氏法进行多重比较;对菌株益生性能评估及小鼠试验检测指标进行t检验。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 适用PB3的FTG包被系统的构建

如表1所示,单宁酸溶液浓度为10 mg/mL时构成的FT-PB3粒径最小,显著低于其他浓度(P<0.05),说明此时FT包被层与PB3的结合最为紧密、黏附力最强。如表2所示,当β-葡聚糖溶液浓度为0.4 mg/mL时,Zeta电位达到峰值,显著低于其他浓度(P<0.05),说明此时FTG包被层与PB3的结合最为稳定。如图1所示,透射电镜可观察制备的FTG-PB3有保护层,扫描电镜可观察到菌体表面粗糙,呈现凹凸不平和褶皱结构。
表1 单宁酸溶液浓度对FT-PB3粒径的影响

Table 1 Effects of TA solution concentration on FT-PB3 particle sizenm

单宁酸溶液浓度
TA solution concentration/(mg/mL)		 粒径
Particle size
0 393.67±9.71c
10 230.67±5.13e
20 339.33±10.60d
30 522.33±37.21b
40 572.67±10.26a
P值 P-value <0.001

同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05)。表2、表3和表4同。

Data in the same column with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 2, Table 3 and Table 4.

表2 β-葡聚糖溶液浓度对FTG-PB3 Zeta电位的影响

Table 2 Effects of Gn solution concentration on FTG-PB3 Zeta potentialmV

β-葡聚糖溶液浓度
Gn solution concentration/(mg/mL)		 Zeta电位
Zeta potential
0 -6.63±0.99a
0.4 -12.70±0.35d
0.8 -11.03±0.47c
1.2 -11.07±0.42c
1.4 -9.85±0.34b
P值 P-value <0.001
图1 PB3和FTG-PB3的透射电镜图和扫描电镜图

图A和B分别为PB3和FTG-PB3的透射电镜图,图C和D分别为PB3和FTG-PB3的扫描电镜图。

Fig.1 TEM and SEM images of PB3 and FTG-PB3

Figures A and B are transmission electron microscopy (TEM) images of PB3 and FTG-PB3, respectively, and figures C and D are scanning electron microscopy (SEM) images of PB3 and FTG-PB3, respectively.

2.2 FTG包被层对PB3生长活性的影响

如表3所示,FTG-PB3组的12 h存活率为100.84%,显著高于FT-PB3组和G-PB3组(P<0.05),而与PB3组差异不显著(P>0.05),说明FTG包被层对PB3的生长活性无负面影响。
表3 FTG包被层对PB3生长活性的影响(以12 h存活率表示)

Table 3 Effects of FTG coating layer on growth activity of PB3 (expressed as 12 h survival rate)%

项目
Items		 12 h存活率
12 h survival rate
PB3组 PB3 group 100.00±2.32a
FT-PB3组 FT-PB3 group 84.61±1.04c
G-PB3组 G-PB3 group 96.39±0.83b
FTG-PB3组 FTG-PB3 group 100.84±1.23a
P值 P-value <0.001

2.3 FTG包被层对PB3抑菌活性的影响

如表4所示,FTG对产肠毒素大肠杆菌的抑菌活性较弱,而PB3及FTG-PB3对产肠毒素大肠杆菌均具有一定的抑菌效果,且二者的抑菌圈直径无显著差异(P>0.05),说明FTG包被层未降低PB3的抑菌活性。
表4 FTG包被层对PB3抑菌活性的影响(以抑菌圈直径表示)

Table 4 Effects of FTG coating layer on antimicrobial activity of PB3 (expressed as inhibition zone diameter)mm

项目
Items		 抑菌圈直径
Inhibition zone diameter
FTG 6.02±0.03b
PB3 21.59±0.57a
FTG-PB3 21.86±0.56a
P值 P-value <0.001

2.4 PB3和FTG-PB3的益生性能比较

2.4.1 耐温能力

如图2所示,通过不同温度条件下的相对存活率情况可知,PB3和FTG-PB3在20~60 ℃均能较好生长,且其最适生长温度为40 ℃,相对存活率达80%以上,表明PB3和FTG-PB3均具有较强的热稳定性。各温度条件下,与PB3相比,FTG-PB3的相对存活率无显著差异(P>0.05)。
图2 PB3与FTG-PB3在不同温度条件下的相对存活率

Fig.2 Relative survival rates of PB3 and FTG-PB3 under different temperature conditions

2.4.2 耐酸和耐胆盐能力

如图3-A所示,在不同pH(5、4、3)条件下,PB3和FTG-PB3的相对存活率均随着pH的降低而下降,但均在40%以上。在各pH条件下,FTG-PB3的相对存活率均显著高于PB3(P<0.05),且均在50%以上,表明FTG包被层可以在酸性环境中为PB3提供良好的保护。
图3 PB3与FTG-PB3在不同pH和不同胆盐浓度条件下的相对存活率

Fig.3 Relative survival rates of PB3 and FTG-PB3 under different pH and different bile salt concentration conditions

如图3-B所示,在不同浓度(0.2%、0.4%、0.6%)胆盐条件下,PB3和FTG-PB3的相对存活率均随着胆盐浓度的升高而下降,但均在30%以上。在各胆盐浓度条件下,FTG-PB3的相对存活率均显著高于PB3(P<0.05),且均在50%以上,表明FTG包被层有效增强了PB3对胆盐的抗性。

2.5 小鼠试验

2.5.1 灌胃FTG-PB3对小鼠生长性能的影响

灌胃FTG-PB3对小鼠生长性能的影响如表5所示,其中小鼠平均日采食量和料重比仅记录数据辅助判断生长性能的变化。饲喂28 d后,与对照组相比,FTG-PB3组小鼠的终末体重和平均日增重显著升高(P<0.05),平均日采食量升高,料重比下降。
表5 灌胃FTG-PB3对小鼠生长性能的影响

Table 5 Effects of FTG-PB3 by gavage on growth performance of mice

项目
Items		 对照组
CON group		 FTG-PB3组
FTG-PB3 group		 P值
P-value
初始体重 IBW/g 21.02±0.67 21.03±0.67 0.970
终末体重 FBW/g 26.72±0.75 27.90±0.51 0.001
平均日采食量 ADFI/(g/d) 4.97 5.14
平均日增重 ADG/(g/d) 0.20±0.01 0.25±0.02 0.001
料重比 F/G 24.85 20.56

2.5.2 灌胃FTG-PB3对小鼠血清炎症因子含量的影响

灌胃FTG-PB3对小鼠血清炎症因子的影响见表6。与对照组相比,FTG-PB3组小鼠血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-6的含量显著降低(P<0.05),抗炎细胞因子IL-10的含量显著增加(P<0.05);血清中IL-22的含量在2组间无显著差异(P>0.05)。
表6 灌胃FTG-PB3对小鼠血清炎症因子含量的影响

Table 6 Effects of FTG-PB3 by gavage on inflammatory factor contents in serum of miceng/L

项目
Items		 对照组
CON group		 FTG-PB3 组
FTG-PB3 group		 P值
P-value
促炎细胞因子 Inflammatory cytokines
肿瘤坏死因子-α TNF-α 982.12±228.13 621.52±134.24 0.016
白细胞介素-6 IL-6 33.33±6.58 15.59±1.93 0.001
抗炎细胞因子 Anti-inflammatory cytokines
白细胞介素-10 IL-10 264.64±58.20 358.78±49.35 0.024
白细胞介素-22 IL-22 145.69±28.06 126.62±39.65 0.410

2.5.3 灌胃FTG-PB3对小鼠肠道形态结构的影响

小鼠回肠组织形态和结肠外观如图4所示。灌胃FTG-PB3对小鼠肠道形态结构的影响见表7。与对照组相比,FTG-PB3组回肠绒毛高度显著升高(P<0.05),隐窝深度显著降低(P<0.05),绒毛高度∕隐窝深度比值显著升高(P<0.05);在结肠长度方面,FTG-PB3组显著高于对照组(P<0.05)。
图4 小鼠回肠组织形态和结肠外观

A:对照组小鼠回肠组织HE染色(50×);B:FTG-PB3组回肠组织HE染色(50×);C:对照组与FTG-PB3组小鼠结肠外观。

Fig.4 Ileal tissue morphology and colon appearance of mice

A: HE staining of ileal tissue of mice in the control group (50×); B: HE staining of ileal tissue of mice in the FTG-PB3 group (50×); C: colon appearance of mice in the control group and FTG-PB3 group.

表7 灌胃FTG-PB3对小鼠肠道形态结构的影响

Table 7 Effects of FTG-PB3 by gavage on intestinal morphology and structure of mice

项目
Items		 对照组
CON group		 FTG-PB3组
FTG-PB3 group		 P值
P-value
回肠 Ileum
绒毛高度 Villus height/μm 535.02±17.18 565.26±20.34 0.019
隐窝深度 Crypt depth/μm 79.57±4.31 72.73±5.14 0.030
绒毛高度∕隐窝深度 V/C 6.73±0.40 7.81±0.68 0.007
结肠 Colon
长度 Length/cm 7.20±0.51 8.92±0.58 0.010

2.5.4 灌胃FTG-PB3对小鼠肠道菌群的影响

2.5.4.1 肠道菌群多样性分析

对2组小鼠肠道菌群进行α多样性分析,其中Ace指数用于衡量群落丰富度,Chao1指数用于衡量物种丰度,Shannon指数和Simpson指数用于衡量物种多样性。如表8所示,灌胃FTG-PB3对小鼠肠道菌群对α多样性没有显著影响(P>0.05)。
表8 灌胃FTG-PB3对小鼠肠道菌群α多样性的影响

Table 8 Effects of FTG-PB3 by gavage on α diversity of intestinal microbiota of mice

项目
Items		 对照组
CON group		 FTG-PB3组
FTG-PB3 group		 P值
P-value
Ace指数 Ace index 402.58±60.55 253.04±170.15 0.149
Chao1指数 Chao1 index 401.33±61.75 252.81±171.24 0.154
Shannon指数 Shannon index 6.07±0.30 5.58±0.88 0.324
Simpson指数 Simpson index 0.96±0.01 0.96±0.02 0.486
Coverage指数 Coverage index 0.99±0.00 0.99±0.00 0.203
肠道菌群β多样性通常用于反映样本间微生物群落组成的差异,图5-A为对照组与FTG-PB3组小鼠肠道菌群的PCoA图,2组间样本显著分离(R2=0.28,P=0.025),说明灌胃FTG-PB3后改变了小鼠肠道菌群结构。图5-B为对照组与FTG-PB3组小鼠肠道菌群的NMDS图,2组间样本显著分离(R2=0.28,P=0.027),应力值(stress)为0.04,小于0.2,说明分组与抽样方法可靠。
图5 灌胃FTG-PB3对小鼠肠道菌群β多样性的影响

A:主坐标分析图;B:非度量多维尺度分析图。

Fig.5 Effects of FTG-PB3 by gavage on β diversity of intestinal microbiota of mice

A: PCoA plot; B:NMDS plot.

2.5.4.2 肠道菌群组成及其优势菌群分析

如图6-A所示,在门水平上,小鼠肠道菌群中相对丰度排在前4位的菌门是拟杆菌门(Bacteroidota)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、弯曲杆菌门(Campylobacterota)。如图6-B所示,在属水平上,小鼠肠道菌群中相对丰度排在前10位的菌属是鼠杆菌科(Muribaculaceae)、未分类的毛螺菌科(Lachnospiraceae_unclassified)、另枝菌属(Alistipes)、毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、拟杆菌属(Bacteroides)、臭气杆菌属(Odoribacter)、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、未分类的颤螺旋菌科(Oscillospiraceae_unclassified)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)。
图6 灌胃FTG-PB3对小鼠肠道菌群门水平(A)和属水平(B)物种组成的影响

Bacteroidota:拟杆菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Proteobacteria:变形菌门;Campylobacterota:弯曲杆菌门;Desulfobacterota:脱硫杆菌门;Actinobacteriota:放线菌门;Patescibacteria:髌骨菌门;Deferribacterota:脱铁杆菌门;Cyanobacteria:蓝菌门;Bacteria_unclassified:未分类的细菌;Others:其他;Muribaculaceae:鼠杆菌科;Lachnospiraceae_unclassified:未分类的毛螺菌科;Alistipes:另枝菌属;Lachnospiraceae_NK4A136_group:毛螺菌科NK4A136群;Bacteroides:拟杆菌属;Odoribacter:臭气杆菌属;Alloprevotella:拟普雷沃氏菌属;Oscillospiraceae_unclassified:未分类的颤螺菌科;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科RC9肠道群;Ligilactobacillus:联合乳杆菌属;Clostridia_vadinBB60_group:梭菌纲vadinBB60群;Clostridia_UCG-014:梭菌纲UCG-014;Helicobacter:螺杆菌属;Escherichia-Shigella:埃希氏菌-志贺氏菌属;Rikenella:理研菌属;Rikenellaceae_unclassified:未分类的理研菌科;Parabacteroides:副拟杆菌属;Prevotellaceae_UCG-001:普雷沃氏菌科UCG-001;Paraprevotella:副普雷沃氏菌属;Desulfovibrionaceae_unclassified:未分类的脱硫杆菌科。

Fig.6 Effects of FTG-PB3 by gavage on species composition at phylum level (A) and genus level (B) in intestinal microbiota of mice

如表9所示,在门水平上,与对照组相比,FTG-PB3组小鼠变形菌门、放线菌门(Actinobacteria)、弯曲杆菌门的相对丰度显著降低(P<0.05);在属水平上,与对照组相比,FTG-PB3组小鼠联合乳杆菌属、副普雷沃氏菌属(Paraprevotella)、理研菌属(Rikenella)、拟普雷沃氏菌属的相对丰度显著升高(P<0.05),而另枝菌属、埃希氏菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)的相对丰度显著降低(P<0.05)。
表9 灌胃FTG-PB3对小鼠肠道菌群中部分菌门和菌属相对丰度的影响

Table 9 Effects of FTG-PB3 by gavage on relative abundance of selected bacterial phyla and genera in intestinal microbiota of mice%

项目
Items		 对照组
CON group		 FTG-PB3组
FTG-PB3 group		 P值
P-value
门水平 Phylum level
变形菌门 Proteobacteria 7.22±2.67 0.25±0.19 0.002
放线菌门 Actinobacteria 0.99±0.14 0.61±0.14 0.009
弯曲杆菌门 Campylobacterota 2.14±0.10 1.43±0.15 0.003
属水平 Genus level
联合乳杆菌 Ligilactobacillus 0.83±0.11 4.33±1.18 0.001
副普雷沃氏菌 Paraprevotella 0.15±0.17 2.44±1.42 0.018
拟普雷沃氏菌 Alloprevotella 1.56±3.13 7.60±3.47 0.042
理研菌属 Rikenella 0.70±0.13 2.14±0.73 0.008
埃希氏菌-志贺氏菌属 Escherichia-Shigella 10.17±1.48 0.01±0.01 0.001
另枝菌属 Alistipes 12.26±4.81 3.43±0.46 0.011

2.5.4.3 差异物种分析

为了找到重要的并且在组间存在显著差异的物种,采用LEfSe分析筛选对照组和FTG-PB3组之间具有统计学差异的物种(筛选标准:|LDA得分|>3,P<0.05)。如图7所示,对照组中起主导作用的差异菌群包括未分类的毛螺菌科、臭气杆菌属、肠球菌属、马尔尼菲菌科(Marinifilaceae)、泰泽菌属(Tyzzerella)和消化球菌属(Peptococcus);FTG-PB3组起主导作用的差异菌群包括联合乳杆菌、乳杆菌属(Lactobbacillus)和拟普雷沃氏菌。
图7 基于LEfSe分析的差异菌群LDA得分图

图中“f_”表示科,“g_”表示属,“o_”表示目,“c_”表示纲。In the figure, “f_” indicates family, “g_” indicates genus, “o_” indicates order, and “c_” indicates class.

Lachnospiraceae_unclassified:未分类的毛螺菌科;Marinifilaceae:马尔尼菲菌科;Odoribacter:臭气杆菌属;Odoribacter_unclassified:未分类的臭气杆菌属;Enterococcaceae:肠球菌科;Enterococcus:肠球菌属;Enterococcus_unclassified:未分类的肠球菌属;Peptococcus:消化球菌属;Peptococcus_unclassified:未分类的消化球菌属;Ruminococcaceae_unclassified:未分类的瘤胃球菌科;Tyzzerella:泰泽菌属;Tyzzerella_unclassified:未分类的泰泽菌属;Lactobacillus_unclassified:未分类的乳杆菌属;Lactobacillus:乳杆菌属;Ligilactobacillus:联合乳杆菌属;Ligilactobacillus_unclassified:未分类的联合乳杆菌属;Lactobacillales:乳杆菌目;Lactobacillaceae:乳杆菌科;Bacilli:芽孢杆菌纲;Alloprevotella:拟普雷沃氏菌属;Alloprevotella_unclassified:未分类的拟普雷沃氏菌属;Prevotellaceae:普雷沃氏菌科。

Fig.7 LDA score plot of differential bacteria based on LEfSe analysis

为了解肠道菌群与血清炎症因子之间的关系,将LEfSe分析中组间存在显著差异的各组的富集微生物与血清炎症因子进行了Spearman相关性分析,相关性热图见图8。如图8-A所示,在对照组富集的马尔尼菲菌科、泰泽菌属与IL-6呈极显著正相关(P<0.01),与IL-10呈显著负相关(P<0.05);臭气杆菌属与IL-6呈显著正相关(P<0.05),与IL-10呈显著负相关(P<0.05);肠球菌属(Enterococcus)与IL-6呈显著正相关(P<0.05)。如图8-B所示,在FTG-PB3组中富集的联合乳杆菌属、乳杆菌属与IL-6呈极显著负相关(P<0.01),与IL-10呈显著正相关(P<0.05);拟普雷沃氏菌属与IL-6呈显著负相关(P<0.05);理研菌属与IL-6呈极显著负相关(P<0.01),与IL-10呈显著正相关(P<0.05),与TNF-α呈显著负相关(P<0.05);而副普雷沃氏菌属与各炎症因子均无显著相关性(P>0.05)。
图8 对照组和FTG-PB3组富集微生物与血清炎症因子的相关性热图

A:对照组富集微生物与血清炎症因子之间的Spearman相关性分析 Spearman correlation analysis between enriched microorganisms and serum inflammatory factors in the control group;B:FTG-PB3组富集微生物与血清炎症因子含量之间的Spearman相关性分析 Spearman correlation analysis between enriched microorganisms and serum inflammatory factors in the FTG-PB3 group。

IL-10:白细胞介素-10 interleukin-10;IL-22:白细胞介素-22 interleukin-22;IL-6:白细胞介素-6 interleukin-6;TNF-α:肿瘤坏死因子-α tumor necrosis factor-α;Enterococcus:肠球菌属;Odoribacter:臭气杆菌属;Marinifilaceae:马尔尼菲菌科;Tyzzerella:泰泽菌属;Lachnospiraceae:毛螺菌科;Peptococcus:消化球菌属;Paraprevotella:副普雷沃氏菌;Lactobacillus:乳杆菌属;Ligilactobacillus:联合乳杆菌属;Alloprevotella:拟普雷沃氏菌属;Rikenella:理研菌属。“*”:显著相关 significant correlation (P<0.05);“**”:极显著相关 extremely significant correlation (P<0.01)。

Fig.8 Heatmaps of correlation between enriched microorganisms and serum inflammatory factors in control group and FTG-PB3 group

3 讨论

3.1 FTG包被层对PB3生长活性和抑菌活性的影响

当益生菌作为口服补充剂时,其在消化道中会面临恶劣环境,导致活性受限,难以保持足够的活力或数量到达肠道以最大程度的发挥作用[10]。因此,饲喂的益生菌必须在减少损失的前提下有效到达肠道并定植于黏膜中。包被技术在此方面表现出良好潜力。在基于金属-酚醛-益生元的包被体系中,Fe3+具有良好的生物相容性,单宁酸已被用作食品添加剂,而β-葡聚糖则被用于天然产物的靶向递送[9]。益生菌通过电荷吸附与Fe3+结合,单宁酸能与多种物质表面形成共价键,与Fe3+发生螯合作用,同时与β-葡聚糖产生氢键及疏水相互作用[11-12]。
经FT单层包被的活性益生菌,其耐受性增强,在消化道中的存活率提升,尤其显著提高益生菌在抗生素存在下的存活率[8]。然而,FT单层包被亦存在局限性,可能抑制益生菌形成生物膜的能力,进而影响其与细胞间的黏附作用。此外,进入酸性的胃环境后,H+会与Fe3+竞争结合单宁酸上的羟基,可能导致FT层的结构发生崩解[13-14]。引入β-葡聚糖可有效缓解这一问题。β-葡聚糖中的羟基官能团不仅能在酸性环境中与H+结合,形成稳定的保护结构,还可与单宁酸协同形成生物膜。作为一种大分子黏性多糖,β-葡聚糖在一定条件下可形成凝胶,具有增稠作用,进入肠道后分解为短链脂肪酸(SCFA),促进肠道蠕动,显著改善肠道环境[12,15]。此外,β-葡聚糖在生物膜形成、感染控制及提高细菌对抗生素敏感性方面也发挥着重要作用,能够弥补单层包被对PB3生物膜完整性和活性的抑制作用,从而有效提高PB3的存活率,且不削弱其本身的抑菌活性[16]。在本试验中,Fe3+、单宁酸与β-葡聚糖的化学计量比为1∶1∶1,旨在形成最小尺寸、最紧凑的金属-酚网络结构。该结构具有更大的比表面积,是包被颗粒所必需的特性[17-18]。臧琳[19]对纳米颗粒的研究表明,Zeta电位达到峰值(即特征峰)时,可视为封装成功。
芽孢杆菌能够分泌具有生物活性的代谢产物,或促进其他有益微生物的增殖,从而产生抗菌活性以抵抗肠道致病菌[20]。本研究中,PB3对大肠杆菌表现出一定的抑制活性,这可能与其产生的细菌素或其编码的基因有关[21]。FTG包被层未对PB3的抑菌活性及生长活性产生不利影响,表明该包被层通过静电吸附和氢键相互作用并未对PB3造成机械性损伤,同时也证实FTG包被层对于益生菌无明显副作用。

3.2 FTG包被层对PB3益生性能的影响

贝莱斯芽孢杆菌属于芽孢杆菌属,其对温度有固有的稳定性,因此在不同温度下保护层的作用并不明显[22]。由于大部分的益生菌以口服的方式饲喂动物,因此,益生菌必须具有耐受胃部的低pH和肠道内高浓度胆盐的能力。胃酸、胆盐构成了消化道内的天然化学屏障,对有害微生物具有杀伤力的同时也影响益生菌的生存和定植。当益生菌经过胃部后,残余的FT层在进入肠道、处于较高pH环境中时,可将包被的益生菌释放出来[8]。因此,FTG包被层在酸性和胆盐条件下提高了PB3的相对存活率,为PB3提供了卓越的保护,使其免受胆盐、低pH的破坏,与前人的报道[23]一致。高璐[24]研究表明,采用4种基于金属-多酚网络的封装策略制备的鼠李糖乳酪杆菌,相较于未包被菌株均表现出更强的抗胃酸和抗胆盐能力。这同样说明本研究中的FT层能够增强益生菌对消化液的抵抗能力,并与益生元层协同发挥保护作用。综上所述,FTG包被层在模拟胃肠道恶劣条件下可有效提升PB3的稳定性、活力及耐受性。

3.3 灌胃FTG-PB3对小鼠生长、肠道形态结构及血清炎症因子含量的影响

贝莱斯芽孢杆菌已被证明能够产生具有抗菌活性的次级代谢产物,并显著提高饲料利用率与免疫力,促进动物增重[4]。体重减轻、免疫防御能力下降等多种疾病被认为与小肠黏膜损伤导致的营养不良密切相关[25]。小肠黏膜表面积较大,绒毛结构完整,绒毛高度增加、隐窝深度降低有利于扩大吸收面积,从而促进营养物质吸收并预防肠道炎症[25-26]。绒毛高度与隐窝深度的比值可反映小肠对营养物质的吸收能力,该比值越高,表明小肠绒毛结构越完整,吸收能力越强[27]。细胞因子的表达量通常与炎症状态密切相关。当组织受损或受到细菌感染时,血清中促炎细胞因子TNF-α和IL-6的含量升高[27]。TNF-α在肠道黏膜中过量表达可能诱导肠上皮细胞凋亡[28],补充益生菌则有助于缓解这一状况,并同时提高IL-10等抗炎细胞因子的含量。通过抑制过度炎症反应并促进组织修复,在感染与炎症期间维持组织稳态方面发挥关键作用,有助于维持肠道免疫耐受[28]。IL-22通常在肠道黏膜愈合中发挥作用,但在炎症性肠病组织损伤最为严重的阶段,其表达量达到峰值,可能助长炎症反应[29]。在结肠炎患者的结肠及回肠末端,IL-22的mRNA表达量显著升高[29]。本研究中,连续灌胃FTG-PB3 28 d后,小鼠体重显著增加,肠道形态改善,血清炎症因子含量得到调节,表明其作为包被益生菌使用具有良好的安全性。

3.4 灌胃FTG-PB3对小鼠肠道菌群的影响

为了进一步探索FTG-PB3对肠道生态系统的微生物群落进行分析。在FTG-PB3组中,拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度升高,其通常参与营养吸收和肠上皮细胞(IECs)的成熟和保护,将多糖转化为可吸收的单糖和短链脂肪酸[5];这些代谢产物在维持肠道微生态平衡和促进肠道黏膜健康方面起着至关重要的作用。相反,变形菌门、弯曲杆菌门和放线菌门的相对丰度显著降低。变形菌门是与肠道疾病关系最为密切的微生物类群之一,其中包括埃希氏菌属、埃希氏菌-志贺氏菌属等产内毒素细菌,易扰乱肠道菌群平衡,诱发肠道疾病[5,26]。本研究中FTG-PB3组小鼠肠道菌群中埃希氏菌-志贺氏菌属相对丰度的降低与上述规律一致。弯曲杆菌是引发腹泻的主要病原菌之一,已有研究证实贝莱斯芽孢杆菌可抑制鸡体内弯曲杆菌的生长[20],本研究中FTG-PB3组小鼠肠道菌群中弯曲杆菌门相对丰度降低的结果也与此一致。
放线菌门在早期慢性肾脏疾病患者及癌症患者胃肠道中的相对丰度显著升高[30]。另枝菌属作为肠道疾病相关优势菌属,与促炎因子呈正相关,可促进炎症发生,并与多种致病菌形成密切联系[31]。在灌胃FTG-PB3后,小鼠肠道菌群中联合乳杆菌属、乳杆菌属、拟普雷沃氏菌属等多种有益菌属的相对丰度有所提升。贝莱斯芽孢杆菌属于芽孢杆菌属,能够在肠道中营造低氧环境,有利于厌氧菌的增殖,从而促进小鼠肠道中联合乳杆菌属相对丰度的增加[32-33]。任广钰[10]研究表明,双菌微胶囊可提高乳杆菌科的相对丰度,降低变形菌门的相对丰度,调节肠道菌群比例,本研究结果与此相吻合。这表明包被处理确实有助于增强芽孢杆菌在肠道中的存活能力,使其能够有效消耗氧气,进而促进乳杆菌的增殖。联合乳杆菌属易于定植于肠上皮细胞膜,具有较强的酸和胆盐耐受性,有助于维持肠道菌群稳定,形成生物屏障,抵抗沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等肠道致病菌的定植,从而缓解肠道感染症状[34]。拟普雷沃氏菌属是增强肠道稳态的重要因素之一,其在短链脂肪酸含量增加中发挥关键作用,且可能为鼠杆菌科的合成提供前体物质,这可能是本研究中FTG-PB3组小鼠鼠杆菌科相对丰度提升的原因[35]。副普雷沃氏菌属可降解肠道中的胰蛋白酶,减少肠道疾病的发生,发挥肠道保护作用,并有助于提高肠道内短链脂肪酸的水平[36]。
LEfSe分析显示了对照组和FTG-PB3组起主导作用的微生物。在对照组中富集的马尔尼菲菌科与炎症状态呈正相关,其相对丰度降低时,炎症水平降低,有助于预防肠道炎症的发生;臭气杆菌属虽能产生短链脂肪酸,具有一定的抗炎作用,但在炎症性肠病及结肠癌中其相对丰度显著升高,因而与促炎因子呈正相关[37];泰泽菌属具有直接致病性,可导致肠道菌群紊乱,通常与免疫性疾病密切相关[38]。在FTG-PB3组中,在所有发生显著变化的菌属中共筛选出4种与炎症因子显著相关的菌属。其中,联合乳杆菌可通过上调抗炎细胞因子IL-10的表达,保护肠黏膜免受损伤,抑制炎症反应的发生[39];拟普雷沃氏菌属相对丰度的升高有助于改善肠道菌群紊乱,并与粪便中丙酸盐、醋酸盐含量呈正相关,从而降低体内炎症水平[33],这可能是其与IL-6呈负相关的原因。理研菌属与肠道黏蛋白及细胞间黏附因子呈显著正相关,与肠道炎症严重程度呈显著负相关,在改善肠道屏障功能方面发挥重要作用[40],这可能是其与IL-10呈显著正相关,并促进FTG-PB3组小鼠肠道形态结构改善的原因。上述结果表明,具备保护层的FTG-PB3能够充分发挥其自身良好的抗炎性能,增加有益菌的相对丰度,同时降低有害菌的相对丰度。因此,FTG-PB3能够调节小鼠肠道菌群结构,提升联合乳杆菌属、拟普雷沃氏菌属、乳杆菌属、理研菌属等有益菌的相对丰度,降低肠球菌属、马尔尼菲菌科等致病菌的相对丰度,从而改善小鼠肠道健康。

4 结论

① 包被材料FTG对PB3无毒害作用,并能有效提升PB3的体外耐受性。
② 利用FTG构建的FTG-PB3可以有效提高小鼠的生长性能,改善肠道形态结构,同时调节肠道菌群结构,从而维持肠道健康。

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