细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由原核生物和真核生物细胞在生理或病理状态下主动分泌的纳米级膜性结构[1],根据EVs生物发生途径、粒径大小及释放机制分为胞外体(ectosomes)和外泌体(exosomes)两大类。如图1所示,胞外体主要通过质膜直接出芽方式形成,其形成机制涉及细胞膜局部区域的脂质重组和细胞骨架重构,成熟后通过膜颈收缩完成释放,粒径在50 nm~1 μm,包括微囊泡(microvesicles)、微颗粒(microparticles)和大囊泡(macroparticles);外泌体的生物发生过程更为复杂,起始于细胞膜内陷形成早期内吞体(early endosome),经成熟转化变为晚期内吞体(late endosome)后,通过内吞体膜向内出芽形成内部囊泡(intraluminal vesicles)[1],后者在多囊泡体(multivesicular bodies)内完成生物分子装载后与质膜融合释放至胞外空间,形成具有完整脂质双分子层膜结构的外泌体,直径为30~150 nm。
图1 胞外体和外泌体的生成及分泌左图中In the left figure,ECTOSOMES:胞外体;Lipid Reorganization:脂质重组;Plasma Membrane Outward Budding:质膜向外出芽;Ectosomes (50 nm-1 μm):胞外体(50 nm~1 μm);Microvesicles:微囊泡;Microparticles:微颗粒;Plasma membrane:质膜;Budding:出芽;Ectosomes:胞外体;Proteins/Nucleic acids:蛋白质/核酸。 右图中In the right figure,EXOSOMES:外泌体;Membrane Invagination:膜内陷;Multivesicular Bodies (MVBs):多囊泡体;Late Endosome:晚期内吞体;Proteins:蛋白质;Metabolites:代谢物;Lipid Bilayer:脂质双层;Exosomes (30-150 nm):外泌体(30~150 nm);Endocytosis:内吞作用;Early endosome:早期内吞体;Intraluminal vesicles (ILVs):内部囊泡;Fusion:融合;Exosomes:外泌体:Proteins/Nucleic acids:蛋白质/核酸。 Fig.1 Generation and secretion of ectosomes and exosomes[7-8] |
EVs作为生物体液的纳米级信号载体,其生物学特性及功能异质性受供体细胞类型与所处微环境的动态调控[2]。EVs可通过参与细胞间通讯,在免疫调节、代谢调控、疾病发生发展以及药物治疗等方面发挥重要的作用[3-4]。首先,EVs可通过携带和传递免疫相关分子平衡免疫系统的激活和抑制;其次,EVs通过内部携带的蛋白质、代谢物和核酸等生物分子调控受体细胞的生物学功能,促进或抑制疾病的发生发展;再次,EVs可被工程化改造装载小分子或核酸药物,并将其靶向递送至特定细胞或组织,从而实现精准的药物输送;最后,EVs通过递送代谢相关分子,参与葡萄糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢及能量代谢的精细调控[5-6]。EVs因其独特的生物学特性,在多个领域有着巨大的应用潜力。本文综述了微生物产生的EVs对畜禽肠道健康的影响,同时阐述了其作为饲料添加剂提高动物生产性能和抗病能力的潜在应用价值,以期为畜禽健康养殖提供参考。
1 微生物EVs的分子组成及分类
20世纪60年代,EVs在常规电子显微镜下首次被观测到,因其形态特征较为明显,相关早期报道难以追溯至单一发现者[9]。细菌细胞膜主要由极性脂质组成,同时具有亲水头部和疏水尾部,使其在水相环境中能够自发组装形成双层膜结构,且进一步自我包裹形成囊泡。基于此,早期研究普遍认为细菌EVs并非细胞的主动分泌产物,而是细胞死亡后膜结构破裂,其脂质成分在水中自发重组形成的“被动产物”[10]。然而,最近的研究结果显示,细菌EVs是活细菌主动释放的产物,而非细菌死亡后被动形成的副产物[11]。20世纪90年代中期以前,研究主要围绕革兰氏阴性菌来源的EVs的结构和功能展开,而对革兰氏阳性菌来源的EVs的功能研究仅仅停留在形态学上的观察,其厚达20~80 nm的细胞壁结构使得传统理论难以解释纳米级EVs的释放机制[10]。直至2013年,Lee等[12]首次分离到了革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌分泌的具有完整膜结构的纳米级EVs,这为进一步探索细菌EVs的生物学功能奠定了基础。
细菌EVs粒径在20~300 nm,内部装载了来自亲本细菌的多种生物活性成分[13]。细菌EVs的分子组成主要包括四跨膜蛋白家族等结构蛋白、基因组DNA片段与各类非编码RNA等核酸成分、以胆固醇和鞘磷脂为代表的特征性膜脂,以及多种小分子代谢产物[14]。根据细菌细胞壁结构和囊泡生物发生机制的差异,细菌EVs分为革兰氏阴性菌的细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)、外-内膜囊泡(outer-intimal membrane vesicles,OIMVs)和革兰氏阳性菌的膜囊泡(membrane vesicles,MVs)[15]。不同类型EVs的分子组成存在显著差异:蛋白质组成上,OMVs富含外膜蛋白和脂多糖(LPS),而OIMVs同时含有外膜和胞质特征蛋白(如外膜蛋白A),MVs则主要携带源于质膜的跨膜蛋白和胞质蛋白;脂质成分方面,OMVs的膜脂以LPS和外膜磷脂为主,OIMVs因内膜来源而含有较多磷脂酰乙醇胺等内膜特征脂质,而MVs的脂质组成则通常更接近其来源细胞的质膜结构[16]。
2 微生物EVs对宿主肠道健康的调控
动物肠道是由宿主细胞、肠道微生物群及可利用营养物质共同构成的复杂生态系统[19]。其中,反刍动物瘤胃微生物群落由细菌、古菌、真菌和原生动物共同构成,被认为是自然界最高效的纤维降解系统。目前,已鉴定到的瘤胃细菌种类多达1 000~2 000种,涵盖20~30个门类,其中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)为优势菌群,核心菌群有200~300种[20]。除细菌外,瘤胃微生物生态系统还包含50~100种以产甲烷菌为主的古菌,20~30种厌氧真菌,以及100~200种纤毛虫等原生动物[21]。瘤胃微生物群通过协同作用将植物生物质中的复合多糖降解并进行厌氧发酵,生成短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs),这些关键代谢产物不仅是宿主能量代谢的重要来源,还在免疫功能调控和环境可持续性方面发挥着核心作用[22]。与反刍动物相比,单胃动物肠道微生物群落的组成较为单一,以细菌为绝对优势类群(占比>99%),物种多样性也显著低于反刍动物。不同单胃动物间的微生物群组成存在明显差异:例如,猪回肠中约95%的细菌为厚壁菌门,而盲肠和结肠中则主要为厚壁菌门和拟杆菌门等[23];禽类小肠中的优势定植细菌主要为厚壁菌门的乳杆菌属和梭状芽孢杆菌属,而盲肠则以拟杆菌门为主[24]。古菌和真菌在单胃动物肠道中的比例极低(<1%),通常仅在高纤维饮食条件下才会有所增加。单胃动物肠道微生物群的主要功能在于通过碳水化合物发酵和SCFAs合成等代谢活动,为宿主提供能量,同时调节免疫功能。
2.1 肠道菌群EVs介导的免疫保护作用
拟杆菌门和厚壁菌门是肠道菌群中的两大优势类群,共同占据了胃肠道定植细菌群落的90%以上[27]。拟杆菌门的多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron,Bt)与厚壁菌门的代表性共生菌普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii,Fp)协同维持肠道稳态。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是先天免疫中关键的跨膜受体家族,能够识别外源性或内源性分子模式并触发免疫应答[28]。Bt来源的EVs可选择性激活表达TLR4的炎症相关树突状细胞(dendritic cell,DC)2亚群,而对不表达TLR4的黏膜相关DC1亚群无明显作用;同时,在炎症性单核细胞与循环单核细胞中分别调控内质网应激/凋亡通路及细胞周期/DNA修复过程;在巨噬细胞中则通过TLR4-丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)轴调控炎症反应,但在溃疡性结肠炎状态下这一作用减弱,进一步研究表明,Bt-EVs可通过TLR4-含TIR结构域的接头蛋白(TIR domain containing adaptor protein,TIRAP)复合物激活核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路,抑制该通路可显著降低NF-κB活化,提示TLR4-TIRAP-NF-κB轴是其EVs介导免疫调控的核心环节[29]。此外,Fp衍生的EVs可通过上调紧密连接蛋白的表达增强肠道屏障功能,并能激活过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)信号通路(包括PPARα、PPARγ和PPARβ/δ),上调其靶基因血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like protein 4,ANGPTL4)的表达,从而进一步改善屏障完整性[30]。
已有研究证实,细菌EVs在调控畜禽肠道免疫细胞时表现出高度的选择性和特异性。Bt和脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis,B. fragilis)是哺乳动物肠道的重要共生革兰氏阴性厌氧细菌,除促进多糖消化外,还通过分泌EVs介导宿主免疫调节[31]。Bt来源的EVs在不同免疫细胞中通过不同TLR通路发挥免疫调控:在DC中主要激活TLR2-髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)通路以促进白细胞介素(interleukin,IL)-12分泌并增强1型辅助性T细胞(type 1 T helper cells,Th1)免疫应答;在巨噬细胞中则更倾向于TLR4-含TIR结构域的接头分子诱导干扰素β(TIR-domain-containing adapter molecule inducing interferon-β,TRIF)通路诱导IL-10等抗炎细胞因子的产生[32]。这种差异性调控在溃疡性结肠炎患者中尤为明显,益生菌刺激后,DC中TLR2、TLR4和TLR9的表达显著下调[33]。
除拟杆菌门和厚壁菌门细菌外,其他共生菌及益生菌来源的EVs亦表现出差异化的免疫调节特性。益生菌大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN)的EVs可显著促进Th1型细胞因子(如IFN-γ、IL-12)的分泌,而共生菌大肠杆菌ECOR12(Escherichia coli ECOR12,E. coli ECOR12)的EVs则优先诱导调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)相关因子[如转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)]并抑制Th17反应,二者的差异是通过调控树突状细胞外泌体中的miRNAs及表面分子实现[36]。同样,双歧杆菌衍生的EVs通过促进IL-10分泌增强抗炎反应,并可增加CD4+与CD8+ T细胞的活性,表现出明显的免疫保护作用[37]。此外,副干酪乳杆菌来源的EVs能够下调LPS诱导的促炎因子表达,并提升IL-10、TGF-β的水平,同时激活内质网应激通路缓解炎症[38]。相比之下,病原菌来源的EVs则常通过不同机制诱发炎症反应。霍乱弧菌来源的EVs通过核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1(nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 1,NOD1)受体激活信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)磷酸化,使IL-8分泌水平升高5倍以上[29];其O395株分泌的OMVs还可刺激肠上皮细胞并诱导DC介导Th2/Th17应答,加剧炎症反应[39]。这些发现揭示了病原菌与共生菌来源的EVs在免疫激活机制上的本质差异。
2.2 肠道菌群EVs介导的黏膜屏障与菌群互作
畜禽肠道黏膜是维系肠道稳态与健康的关键屏障,由上皮细胞、黏液层、免疫细胞及微生物群共同构成,具备物理、化学和微生物等多重防御机制。其中,上皮细胞通过紧密连接蛋白形成的物理屏障可以防止病原体和毒素进入体内,而杯状细胞分泌的黏液层覆盖上皮表面,进一步减少病原菌与上皮细胞的直接接触[40]。肠道黏膜分泌的抗菌肽和消化酶(如溶菌酶)构成的化学屏障可以直接杀灭或抑制病原菌的生长[41]。此外,黏膜固有层中的免疫细胞和分泌型免疫球蛋白A形成免疫屏障,识别并清除病原体同时诱导免疫耐受以避免过度免疫反应。肠道黏膜表面的有益菌群通过竞争性排斥和代谢产物抑制病原菌定植来形成微生物屏障,其还具备自我修复能力,能够通过上皮细胞更新和信号分子促进损伤修复[42]。上述各层防御相互依赖、协同作用,共同构成对外界病原菌挑战的第1道防线。
细菌EVs可携带多种毒力因子、核酸和代谢产物等,通过多种途径介导宿主致病或促进病原菌定植。首先,某些病原菌EVs含有蛋白酶或其他降解酶,能直接降解上皮细胞的紧密连接蛋白,增加肠道通透性[如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P. aeruginosa)来源的EVs通过蛋白酶破坏紧密连接][43];其次,EVs所携带的LPS、肽聚糖等病原相关分子模式可被宿主的TLR等模式识别受体识别,激活TLR/NF-κB等炎症通路,引发过度的炎性反应并造成组织损伤;最后,EVs可充当“分子特洛伊木马”,将细菌毒力蛋白或小分子直接传递入宿主细胞内,从而干扰细胞信号、诱导细胞凋亡或触发自噬,利于病原菌的侵袭与慢性感染建立[15]。此外,EVs递送的细菌核酸可调控宿主基因表达,通过竞争性吸附或中和宿主抗菌分子帮助病原菌回避免疫清除,这些机制共同赋予EVs在致病过程中的关键作用。
除了直接损伤宿主外,细菌EVs在微生物群落生态与病原控制中亦扮演复杂角色。一方面,某些病原菌或共生菌EVs含有抗生素降解酶或抗菌肽,可改变周围菌株的存活或耐药表型,例如P. aeruginosa在指数生长期分泌的EVs能够促进生物膜生长,而在死亡/存活期分泌的EVs则可有效抑制甚至消除成熟生物膜,表明EVs在群体竞争中可发挥抑制或增强优势的双向功能[44];另一方面,EVs能干预生物膜形成的关键步骤,从而影响病原菌的定植能力。例如,小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica Y1083,Y. enterocolitica Y1083)来源的OMVs通过其中的LPS成分降低细菌的运动能力并下调与生物膜形成相关基因的表达,从而显著抑制该菌及其他病原菌(如沙门氏菌)的生物膜初期形成,而对细菌生长无明显影响[45]。此外,细菌EVs已被证实能够介导细菌种内及种间通讯,并在调节宿主免疫反应中发挥重要作用[46]。
某些益生菌来源的EVs在抗炎与修复肠道损伤方面表现出良好的功能特性。例如,丁酸梭菌(Clostridium butyricum,C. butyricum)分泌的EVs在葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的结肠炎模型中可显著降低疾病活动指数、缓解体重下降、恢复结肠长度并改善组织学损伤表现[47-48]。C. butyricum分泌的EVs可通过调节巨噬细胞极化方向——促使其向M2表型(抗炎型)转变,并抑制其向M1表型(促抗炎型)转变,同时促使有益菌(如乳酸菌)丰度增加并抑制潜在致病菌,从而重塑肠道微生态并改善免疫微环境[49]。总体而言,细菌EVs在肠道微生态与宿主互作中既具有潜在的致病性(如递送毒力因子),也具有调节微生物群落和抑制病原菌定植的能力[50]。这种双重功能使EVs成为理解病原菌侵袭、群体竞争与黏膜稳态的重要研究对象,同时为基于EVs的防治策略提供了新的思路。后续研究需聚焦于EVs成分功能的精确定量识别、体内动态与靶向分布以及在不同宿主与生产环境下的安全性与可控性评估,以便将基础发现转化为可操作的疾病防控或生产应用方案。
2.3 肠道菌群EVs在营养代谢中的作用
肠道菌群衍生的EVs携带多种生物活性物质,可穿过肠道上皮屏障进入循环系统,直接或间接调控宿主全身代谢和稳态[51]。肠道菌群EVs可作为重要的分子传递工具,将菌群信号和代谢物传递到肝脏、脂肪组织等代谢器官,从而广泛影响能量消耗、脂质合成和胰岛素信号通路[51-52]。研究显示,肠道菌群EVs介导的细胞间通讯可重塑葡萄糖稳态和脂质代谢,EVs通过递送的miRNAs和蛋白质,可改变肝脏和脂肪组织中PPAR等关键因子的表达,促进脂肪酸氧化并抑制肝脏内源性脂肪生成。有研究提示,肥胖或糖尿病动物的外周血浆EVs中某些miRNAs表达改变(如miR-27a/b上调)可下调白色脂肪组织中PPARα的表达,抑制脂肪酸氧化、促进游离脂肪酸释放,进而诱发脂肪组织炎症并通过血液循环作用于肝脏,加速PPARα介导的新生脂质合成,导致肝脏脂肪变性[53]。综上可知,肠道菌群EVs通过SCFAs等代谢物的递送和信号分子的传递,在宿主能量代谢调控中发挥重要作用[54]。
肠道菌群和其EVs与代谢疾病密切相关。细菌EVs可以改善胰岛素敏感性、调节血糖平衡。例如,益生菌EcN分泌的OMVs(EcN-OMVs)在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中显著降低了体重和空腹血糖水平,并提高了血浆胰岛素水平,EcN-OMVs可改变肠道菌群结构,提高SCFAs产生菌的丰度,增加肠道SCFAs浓度,同时调节肠道氨基酸代谢(如鸟氨酸循环中鸟氨酸和延胡索酸的含量)[55]。这些代谢变化使得更多SCFAs被运送至肝脏(通过门静脉),在肝脏内可下调环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX2)介导的促炎信号并抑制ω-6多不饱和脂肪酸的代谢途径,从而减轻肝脏脂肪堆积和胰岛素抵抗[56]。值得注意的是,这种效果在高脂饮食模型中最为明显,当胰岛β细胞被链脲佐菌素不可逆损伤后,EcN-OMVs对空腹血糖的改善作用则明显减弱(因基础胰岛素分泌严重不足)。除此之外,含有细菌EVs的制剂可以通过调控关键代谢酶的表达改善糖代谢。嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila,AKK)定植于肠道黏膜,在调节代谢平衡及宿主稳态等方面发挥作用。研究表明,AKK分泌的OMVs通过Amuc 1100蛋白刺激黏液分泌并利用外膜蛋白P9促进胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide,GLP)-1和GLP-2的分泌,从而参与血糖平衡的调节[57]。此外,AKK来源的OMVs及其外膜蛋白能够有效调节肠道稳态并改善代谢健康[58]。肠道菌群EVs可通过代谢-免疫双向调控网络影响宿主代谢稳态与炎症状态,其在代谢性疾病中的作用机制有待进一步整合多组学研究阐明。由此可见,肠道细菌EVs可能通过多靶点、多途径的方式参与糖代谢和脂代谢的调节,是潜在的新型代谢疾病干预靶点。
3 微生物EVs作为饲料添加剂的应用潜力
微生物EVs在促进动物生长与改善饲料转化率方面表现出较大的潜力。部分微生物EVs可携带或促进产生消化酶(如纤维素酶、淀粉酶),帮助分解饲料中的难消化成分(如非淀粉多糖),从而提高营养物质的可利用率与饲料转化率;一些菌株来源的EVs(如Bt-EVs)通过降解复杂多糖并释放有益SCFAs,既为宿主提供直接能量底物,又通过SCFAs调节肠道代谢与上皮稳态,利于生长性能的提升与肠道健康的维持[59]。与此同时,来自AKK等菌株的EVs可上调紧密连接蛋白表达,增强上皮屏障完整性,降低肠道通透性并预防“肠漏”相关的系统性炎症,这些作用进一步间接有利于营养吸收与生长效率的提升[60]。此外,细菌EVs既可直接抑制致病菌也能调动宿主免疫实现长期保护,如乳酸菌来源的EVs含有细菌素或其他具有强效抑菌活性的分子,可直接抑制大肠杆菌、沙门氏菌等常见病原菌的生长;部分细菌EVs还能通过竞争性夺取金属离子或携带酶类(如β-内酰胺酶)改变邻近菌群的生存条件,从而影响耐药菌的定植能力[15];在免疫调节方面,双歧杆菌等益生菌来源的EVs可促进Treg分化并上调抗炎细胞因子表达,从而抑制过度炎症、维持肠道免疫稳态并改善微环境稳定性[37];植物乳杆菌来源的EVs能诱导大鼠巨噬细胞样Raw264细胞产生IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-12,并刺激大鼠派尔集合淋巴结细胞,促进免疫球蛋白A的生成;进一步的研究表明,EVs中脂蛋白Lp19180的酰化N端肽段可通过特异性激活TLR2信号通路,介导上述对小鼠先天性及获得性免疫应答的双重激活作用[61]。微生物EVs作为饲料添加剂,兼具载体稳定性、生物安全性和多重功能调节潜力,既能提升营养利用与生长性能,又能精准调控肠道免疫与菌群平衡,展现出替代传统益生菌与抗生素的应用前景。
4 小结与展望
微生物EVs在畜禽肠道中展现出显著的双向调控作用:一方面,益生菌来源的EVs可通过递送蛋白质、核酸与代谢物增强上皮紧密连接、促进黏膜修复并调节免疫应答,从而改善营养物质的消化吸收与宿主能量代谢;另一方面,致病菌来源的EVs可携带毒力因子或病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),破坏屏障、激活炎症或直接损伤细胞,成为病原菌传播与诱导疾病的重要介质。基于微生物EVs与宿主肠道多靶点、多途径的互作机制,EVs有望成为新型代谢疾病干预靶点。总体来看,微生物EVs作为免疫调节剂和功能性饲料添加剂具有良好的应用潜力,未来研究应聚焦于标准化制备工艺、质量控制体系以及安全评价标准的建立。
随着分离和表征技术的进步,科学家们发现胞外空间远比想象中复杂。新近发现的非囊泡性细胞外纳米颗粒(non-vesicular nanoparticles,NVEPs)与EVs共存于胞外环境且粒径分布存在重叠,现有技术手段无法将两者完全分离,且NVEPs也可携带特定蛋白质、RNA等分子,生物学特性可能与EVs存在交叉[62]。然而,目前针对NVEPs的研究仍较为有限,尚未建立标准化的分离与分析方法,其结构及功能有待进一步探索。