Chinese Journal of Animal Nutrition >

2026 , Vol. 38 >Issue 6: 4552 - 4562

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.365

RESEARCH PAPER

Effects of Conditional Knockout of Melanocortin-4 Receptor Gene on Intramuscular Fat Deposition in Mice

  • ZHANG Zelin , 1, 2, 3 ,
  • LI Penghui 1, 2, 3 ,
  • HE Yang 1, 2, 3 ,
  • LIU Haodong 1, 2, 3 ,
  • YU Mingyang 1, 2, 3 ,
  • LI Xiaolong 1, 2, 3 ,
  • YANG Wenchao 1, 2, 3 ,
  • HAO Qinqin 1, 2, 3 ,
  • DU Chenguang , 1, 2, 3, 4, *
Expand
  • 1 College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
  • 2 Key Laboratory of Veterinary Basis and Disease Prevention and Control of Herbivorous Livestock in Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010018, China
  • 3 Higher Education Institutions Key Laboratory of Animal Embryo and Developmental Engineering at Autonomous Region Level, Hohhot 010018, China
  • 4 Vocational Technical College, Inner Mongolia Agricultural University, Baotou 014109, China
* professor, E-mail:

Received date: 2025-08-28

  Online published: 2026-06-13

Fold

Abstract

In this experiment, 8-week-old male MC4RFlox/Flox mice were selected to conditionally knock out the melanocortin-4 receptor (MC4R) gene in the tibialis anterior muscle (TA) region using AAV2/9-CAG-Cre-EGFP virus, thereby establishing a Cre-LoxP conditional knockout model (CKO model) to investigate the effect of the MC4R gene on intramuscular fat deposition. A total of four groups were set up in the experiment and treated as follows: 1) normal control group (NC group), 4 wild-type mice fed a conventional basal diet; 2) control group (CON group), 4 MC4RFlox/Flox mice injected with 6 mL of normal saline into the left TA and fed a high-fat diet; 3) conventional MC4R knockout group (KO group), 4 MC4R-/- mice fed a high-fat diet; 4) conditional MC4R knockout group (CKO group), 4 MC4RFlox/Flox mice injected with 6 mL of AAV2/9-CAG-Cre-EGFP virus at a titer of 1×1012 vg/mL into the left TA and fed a high-fat diet. At 9 weeks after AAV2/9-CAG-Cre-EGFP virus injection, the mice in each group were anesthetized and then euthanized by cervical dislocation. The TA tissues were quickly isolated for subsequent measurements. The results showed that, compared with the CON group, the protein relative expression level of MC4R in the TA of the CKO group was significantly downregulated (P<0.05). Hematoxylin-eosin (HE) and oil red O staining revealed obvious fat deposition in the TA, a notable increase in TA volume, and a significant increase in TG content in the TA (P<0.05), indicating that conditional knockout of the MC4R gene leaded to intramuscular fat deposition. Compared with the CON group, the mRNA relative expression levels of the adipogenesis-related genes acetyl-CoA carboxylase (ACC) and fatty acid synthase (FAS) in the TA of the CKO group were significantly increased (P<0.05). Furthermore, compared with the CON group, the protein relative expression levels of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (pERK), uncoupling protein 1 (UCP1), peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), adipocyte protein 2 (aP2) and phosphorylated serine/threonine protein kinase (pS6K1) in the TA of the CKO group were significantly increased (P<0.05), while the protein relative expression levels of phosphorylated AMP-activated protein kinase (pAMPK) and phosphorylated hormone-sensitive lipase (pHSL) were significantly decreased (P<0.05). These results suggest that conditional knockout of the MC4R gene induces intramuscular fat deposition in mice by enhancing adipocyte transcriptional differentiation and regulating fatty acid oxidative metabolism. This may provide a theoretical reference for exploring the mechanisms underlying the formation of marbled beef.

Key words： melanocortin-4 receptor; Cre-LoxP; tibialis anterior muscle; fat deposition

Cite this article

ZHANG Zelin , LI Penghui , HE Yang , LIU Haodong , YU Mingyang , LI Xiaolong , YANG Wenchao , HAO Qinqin , DU Chenguang . Effects of Conditional Knockout of Melanocortin-4 Receptor Gene on Intramuscular Fat Deposition in Mice[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2026 , 38(6) : 4552 -4562 . DOI: 10.12418/CJAN2026.365

黑皮质素-4受体(MC4R)是中枢黑皮质素通路中体重调节的关键受体[1]。当机体感知到瘦素、胰岛素等外周代谢信号升高后,MC4R通过促进能量消耗并抑制食欲,影响脂肪沉积和代谢[2-3]。MC4R广泛表达于全身,包括中枢神经系统和外周器官[4]。作为调控肥胖的关键靶点,MC4R的激活能改善胰岛素敏感性并有助于减轻肥胖[5]。
肉质的关键决定因素之一是大理石花纹,而肌内脂肪(IMF)形成、脂质合成、脂肪生成、脂肪细胞发育和脂质积累的过程共同促成肉牛的大理石花纹样的脂肪沉积[6]。肌内脂肪的含量取决于肌内脂肪细胞的数量及其合成脂肪的能力[7]。肌内脂肪细胞来源于脂肪祖细胞或间充质干细胞,受中枢神经核团作用调控其分化为前脂肪细胞,同时交感神经系统调节使脂肪因子升高,促脂肪细胞生成[8]。
尽管中枢神经系统的MC4R在能量代谢调控中的作用已有报道,但其在调节肌肉脂肪形成过程中的功能尚不清楚[9]。MC4R基因全身性敲除小鼠(MC4R-KO小鼠)表现为肥胖,伴随全身性的脂肪过度沉积[10]。传统的基因敲除技术具有全身性和非特异性,且MC4R对外周器官代谢存在直接调控作用[11]。鉴于MC4R基因在肌肉组织中亦有表达,本研究提出假设:肌肉中MC4R基因的缺失可能导致该组织内脂肪沉积。
MC4R基因敲除技术已形成“全身性-组织/细胞特异性”体系,不同方式对应差异化的代谢表型[12]。全身性MC4R基因敲除会引发严重肥胖和食欲亢进,是肥胖相关研究的常用模型[13]。基于Cre-LoxP系统的条件性敲除则可实现精准的组织特异性失活,例如,VGLUT2-Cre介导的中枢谷氨酸能神经元敲除能模拟全身性敲除的肥胖和食欲亢进表型[14];POMC-Cre靶向弓状核阿黑皮素原(POMC)神经元的敲除会导致食欲增加、能量消耗受损及体重上升[15]。Phox2b-Cre介导的自主神经系统节前中间外侧核(IML)神经元敲除虽不影响体重与产热,却诱发高胰岛素血症[16]。这些研究为解析MC4R在不同组织的功能特异性提供了关键工具。
基于上述背景,本研究通过给MC4RFlox/Flox小鼠局部注射AAV2/9-CAG-Cre-EGFP病毒,识别胫骨前肌(TA)内MC4R基因两侧的LoxP位点并敲除MC4R基因片段,以实现该组织中MC4R的定点失活,探究肌肉中MC4R基因缺失对肌内脂肪沉积的调控机制,为改善牛肉品质提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

MC4RFlox/Flox小鼠、MC4R-/-小鼠,雄性,6~8周龄,体重(20±2) g,购自上海南方模式生物科技股份有限公司;无特定病原体(SPF)级C57BL/6J野生型小鼠,雌性,6~8周龄,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司;将2只雄性MC4RFlox/Flox小鼠与雌性C57BL/6J野生型小鼠杂交及再纯繁,获得适合实验室当前环境的8周龄雄鼠MC4RFlox/Flox小鼠,体重(20±2) g。

1.1.2 主要试剂与仪器

主要试剂:兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体(AF702,AFFINITY,美国)、IRDye® 800CW驴抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(926-32213,LI-COR,美国)、AAV2/9-CAG-Cre-EGFP病毒(K240627,BrainVTA,武汉枢密脑科学技术有限公司)、RNA提取试剂盒[S81105,TIANGEN,天根生化科技(北京)有限公司]、兔源解偶联蛋白1(UCP1)单克隆抗体(ab209483,Abcam,英国)、兔源MC4R多克隆抗体(DF4984,AFFINITY,美国)、兔源磷酸化细胞外调节蛋白激酶(pERK)单克隆抗体(4370,Cell Signaling Technology,美国)、兔源磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)单克隆抗体(ab133448,Abcam,英国)、兔源磷酸化核糖体蛋白S6激酶1(pS6K1)单克隆抗体(ab323272,Abcam,英国)、小鼠源过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)单克隆抗体(66936-1-Ig,Proteintech,美国)、兔源脂肪细胞蛋白2(aP2)多克隆抗体(12802-1-AP,Proteintech,美国)、兔源磷酸化激素敏感性脂肪酶(pHSL)重组单克隆抗体(bsm-61260R,Bioss,北京博奥森生物技术有限公司)、甘油三酯(TG)检测试剂盒(A110-1-1,南京建成生物工程研究所)、改良油红O染色试剂盒(C058M,上海碧云天生物技术有限公司)、苏木素染色液(C0107,上海碧云天生物技术有限公司)、伊红染色液(BA4022,珠海贝索生物技术有限公司)。
主要仪器:冰冻切片机(MNT,SLEE,德国)、石蜡切片机(HistoCore BIOCUT,Leica,德国)、激光共聚焦显微镜(C2,Nikon,日本)、双色激光扫描成像系统(Odyessy,LI-COR,美国)。

1.2 试验方法

试验共设置4个组,分别进行如下处理:1)正常对照组(NC组),4只野生型小鼠,饲喂常规基础饲粮[含4%脂肪的全价营养饲粮,由斯贝福(北京)生物技术有限公司生产,货号F002];2)对照组(CON组),4只MC4RFlox/Flox小鼠,在左侧TA注射6 μL生理盐水,饲喂高脂饲粮[含60%脂肪的全价营养饲粮,由斯贝福(北京)生物技术有限公司生产,货号SFD014];3)全身性敲除MC4R基因组(KO组),4只MC4R-/-小鼠,饲喂高脂饲粮;4)条件性敲除MC4R基因组(CKO组),4只MC4RFlox/Flox小鼠,在左侧TA注射6 μL滴度为1×1012 vg/mL的AAV2/9-CAG-Cre-EGFP病毒,饲喂高脂饲粮。
采用肌肉多点注射法进行AAV2/9-CAG-Cre-EGFP病毒注射,具体方法如下:小鼠经异氟烷吸入麻醉后,固定于脑立体定位仪上,暴露TA,将25 μL Hamilton微量进样针连接至微量注射泵,精准定位后于单侧TA进行4点注射,每位点注射1.5 μL病毒液(滴度为1×1012 vg/mL),注射速率0.5 μL/min,总注射量6 μL。注射完成后,进样针留针3 min以防止回流,随后缓慢拔出。术毕以抗生素软膏涂抹伤口,缝合切口。
试验小鼠饲养于相同的环境中,温度控制在(22±2) ℃,相对湿度为40%~70%,采用12 h明/12 h暗循环照明,自由摄食与饮水。AAV2/9-CAG-Cre-EGFP病毒注射后9周,各组小鼠经麻醉后采用颈椎脱臼法处死,迅速分离TA组织。所有动物试验操作均经内蒙古农业大学动物福利与伦理委员会批准(批准ID:NND2025006)。

1.3 指标测定

1.3.1 荧光成像检测

从4 ℃避光环境中取出封片后的TA组织冰冻切片,擦净载玻片背面,将其平稳置于显微镜载物台上,用压片夹固定,调节载物台位置,在低倍镜明场下调焦,定位下丘脑目标核团区域;随后切换至荧光成像模式,选择488 nm蓝光通道,在低倍镜下框选包含目标核团的完整视野并记录其位置;最后切换至中倍镜,精细对焦至核团内细胞轮廓清晰后,进行图像采集。

1.3.2 苏木精-伊红(HE)染色观察

取适量TA组织置于4%多聚甲醛固定液固定24 h,之后用流动自来水冲洗12 h,以去除残留的固定液。将冲洗后的肌肉组织经梯度乙醇(70%、80%、90%、95%和100%乙醇)脱水后,浸入二甲苯中透明处理2 h。透明化后的肌肉组织依次浸入软蜡Ⅰ 15 min、软蜡Ⅱ 30 min进行透蜡处理,随后转入硬蜡中包埋成块。使用石蜡切片机制备厚度为5 μm的连续切片,切片在40 ℃水浴(含40%乙醇)中展平,捞片后于57 ℃烤片30 min,使切片牢固贴附。二甲苯(Ⅰ和Ⅱ阶段各5 min)脱蜡,二甲苯-无水乙醇(1∶1)处理1 min;无水乙醇至80%乙醇逐步处理共3 min,蒸馏水洗后苏木素染色液染色8 min;接着碳酸锂处理1 min并自来水洗2 min;70%~95%乙醇梯度脱水(各2 min),伊红染色液染色40 s;2次95%乙醇短时处理,2次无水乙醇脱水(各5 min);二甲苯-无水乙醇(1∶1)处理2 min,2次二甲苯处理(各5 min);完成透明化后封片,室温晾干后于光学显微镜下观察、采集图像。

1.3.3 油红O染色观察

取小鼠的TA组织,经30%蔗糖溶液脱水、OCT包埋后制备冰冻切片;切片室温干燥10 min后,加入适量染色洗涤液覆盖样品20 s;吸除染色洗涤液,取适量改良油红O染色液,滴加于切片上,染色15 min;去除改良油红O染色液,将适量染色洗涤液滴加于切片上,静置30 s,然后去除染色洗涤液,浸入蒸馏水中置于摇床洗涤20 s;苏木素染色液染色20 s,染色完成后使用水性封片液封片,立即于光学显微镜下观察、采集图像。

1.3.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测

取小鼠的TA组织,应用SYBR Green荧光定量法检测成脂通路相关基因——过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)的mRNA相对表达量,引物序列见表1。反应体系为20 μL。反应程序为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,59.5~61.0 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循环40次。以GAPDH为内参基因,采用2-ΔΔCt法计算PPARα、ACC、FAS的mRNA相对表达量。
表1 实时荧光定量PCR所用引物序列

Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

基因名称
Gene names		 引物序列
Primer sequence (5'—3')		 产物长度
Product length/bp		 退火温度
Annealing
temperature/℃
过氧化物酶体增殖物激活受体α
PPARα		 F:TGTTCGCCAAGGTGCTCCAG
R:GCTCATGTCTGTCTCTGTCTTCTTG		 101 58.5
乙酰辅酶A羧化酶
ACC		 F:AGCAGATCCGCAGCTTGGT
R:ACTTCTGCTCGCTGGGTGG		 136 60.5
脂肪酸合成酶
FAS		 F:GCTGGCATTCGTGATGGAGTCGT
R:AGGCCACCAGTGATGATGTAACTCT		 162 61.0
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
GAPDH		 F:GGTGAAGGTCGGTGTGAACG
R:CTCGCTCCTGGAAGATGGTG		 233 60.0

1.3.5 Western Blot检测

取小鼠TA组织,置于含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中,使用电动匀浆器匀浆后,进行超声破碎处理;采用BCA法测定蛋白质浓度,并调整各样本至等浓度后,使用5%~12%的梯度凝胶进行电泳,电泳结束后采用湿转法将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜;转印膜在5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭1 h,随后与相应一抗GAPDH(1∶5 000)、MC4R(1∶1 000)、pERK(1∶1 000)、PPARγ(1∶1 000)、aP2(1∶1 000)、pS6K1(1∶1 000)、pAMPK(1∶1 000)、pHSL(1∶1 000)及UCP1(1∶1 000)4 ℃孵育过夜;次日,经TBST充分洗涤后,与荧光标记的驴抗兔二抗室温孵育1 h,然后经双色激光扫描成像系统扫描获得蛋白荧光值。目的蛋白的相对表达量以目的蛋白荧光值与内参蛋白(GAPDH)荧光值的比值表示。

1.3.6 TA中TG含量检测

取小鼠TA组织,精确称取组织重量,按照TG检测试剂盒说明进行操作,测定TA中TG含量。

1.4 数据统计与分析

使用GraphPad Prism 9软件对试验数据进行统计分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)并结合Tukey法进行组间差异比较。显著性水平设定为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 TA中MC4R基因敲除效率验证

通过注射AAV2/9-CAG-Cre-EGFP病毒条件性敲除小鼠TA区域内的MC4R基因,可建立条件性敲除模型(CKO模型)(图1-A)。若在目标肌肉组织中检测到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)阳性信号,则表明AAV2/9-CAG-Cre-EGFP病毒已成功感染并表达。荧光检测结果显示,注射AAV2/9-CAG-Cre-EGFP病毒9周后,在注射部位可观察到明显的绿色荧光(图1-B);同时,Western Blot检测结果显示,CKO组小鼠TA中MC4R蛋白相对表达量与CON组相比显著降低(P<0.000 1,图1-C)。以上结果表明,小鼠TA中的MC4R基因已被有效敲除,CKO模型成功建立。
图1 TA中MC4R基因敲除效率

A:CKO模型构建示意图;B:TA中EGFP荧光表达;C:TA中MC4R蛋白的Western Blot检测及相对定量分析;D:体形和TA表型变化;E:TA重量、体重和TA重量/体重比值变化。NC:正常对照组;CON:对照组;KO:全身性敲除MC4R基因组;CKO:条件性敲除MC4R基因组。以P<0.05为差异具有统计学意义,图中ns表示P>0.05,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.000 1。下图同。

Fig.1 MC4R gene knockout efficiency in TA

A: schematic diagram of establishment of CKO model; B: expression of EGFP fluorescence in TA; C: Western Blot detection and relative quantification analysis of MC4R protein in TA; D: changes in body shape and TA phenotype; E: changes of TA weight, body weight and TA weight/body weight ratio. NC: normal control group; CON: control group; KO: systemic MC4R gene knockout group; CKO: conditional MC4R gene knockout group. P<0.05 was considered statistically significant. In the figure, ns indicated P>0.05, * indicated P<0.05, ** indicated P<0.01, *** indicated P<0.001, and **** indicated P<0.000 1. The same applied to the following figures.

图1-D显示,与CON组相比,CKO组小鼠的TA体积明显增大,但体形无明显变化。图1-E显示,KO组小鼠的TA重量显著高于NC组(P<0.01)和CON组(P<0.001),CKO组的TA重量也显著高于NC组(P<0.01)和CON组(P<0.01);KO组小鼠的体重显著高于NC组、CON组和CKO组(P<0.000 1);CKO组小鼠的TA重量与体重比值显著高于NC组(P<0.05)和CON组(P<0.01),而KO组该比值与NC组和CON组无显著差异(P>0.05)。

2.2 TA中敲除MC4R基因对肌内脂肪沉积的影响

小鼠TA组织HE染色结果显示,未注射病毒的NC组小鼠TA表现为肌纤维排列有序,间隙分布均匀,形成蜂窝状致密结构(图2-A);注射生理盐水的CON组小鼠TA表现与NC组小鼠无明显差别(图2-B);全身性敲除MC4R基因的KO组小鼠TA表现为肌纤维呈长条形或不规则形,排列紊乱,分布不均匀,且切片中可见明显的脂肪细胞聚集(图2-C);TA中注射病毒条件性敲除MC4R基因的CKO组小鼠TA内亦出现脂肪细胞聚集(图2-D)。
图2 TA成脂形态与TG含量

A:NC组TA组织HE染色切片观察;B:CON组TA组织HE染色切片;C:KO组TA组织HE染色切片;D:CKO组TA组织HE染色切片;E:TA中TG含量。图中箭头所示为脂肪细胞聚集。

Fig.2 TA adipogenic morphology and TG content

A: observation of HE-stained section of TA tissue from the NC group; B: observation of HE-stained section of TA tissue from the CON group; C: observation of HE-stained section of TA tissue from the KO group; D: observation of HE-stained section of TA tissue from the CKO group; E: TG content in TA. The arrows in the figure point to the accumulation of adipocytes.

如图2-E所示,CKO组和KO组小鼠TA中TG含量显著高于CON组(P<0.000 1)。以上结果表明,肌肉中MC4R基因的表达缺失会导致脂肪在肌肉组织内异常沉积。

2.3 TA中敲除MC4R基因对脂代谢相关基因表达的影响

小鼠TA组织油红O染色结果表明,CON组、NC组小鼠TA组织中脂滴分布稀疏,脂质含量较低,反映正常状态下肌肉组织脂质含量较低(图3-A、图3-B);KO组小鼠TA组织中脂质沉积异常,脂滴体积增大、融合成片(图3-C);CKO组小鼠TA组织中脂滴数量高于CON组但低于KO组(图3-D),表明MC4R基因敲除导致肌肉中脂肪沉积增加。
图3 TA中敲除MC4R基因对脂代谢相关基因表达的影响

A:NC组TA组织油红O染色切片观察;B:CON组TA组织油红O染色切片观察;C:KO组TA组织油红O染色切片观察;D:CKO组TA组织油红O染色切片观察;E:TA组织中PPARα、ACC和FAS mRNA表达的相对定量分析。

Fig.3 Effects of MC4R gene knockout in TA on expression of lipid metabolism-related genes

A: observation of oil red O-stained section of TA tissue from the NC group; B: observation of oil red O-stained section of TA tissue from the CON group; C: observation of oil red O-stained section of TA tissue from the KO group; D: observation of oil red O-stained section of TA tissue from the CKO group; E: relative quantitative analysis of PPARα, ACC and FAS mRNA expression in TA tissue.

RT-qPCR结果(图3-E)显示,KO组TA中PPARα的mRNA相对表达量最高,显著高于CKO组(P<0.05)、CON组(P<0.001)和NC组(P<0.001),CKO组次之,亦显著高于CON组和NC组(P<0.05);KO组和CKO组TA中ACC的mRNA相对表达量显著高于CON组和NC组(P<0.000 1);KO组TA中FAS的mRNA相对表达量最高,显著高于CKO组(P<0.01)、CON组(P<0.000 1)和NC组(P<0.000 1),CKO组次之,亦显著高于CON组(P<0.001)和NC组(P<0.000 1)。上述结果提示,敲除MC4R基因可能通过上调脂生成相关基因的表达,诱导肌肉中脂肪沉积。

2.4 TA中敲除MC4R基因对脂代谢相关蛋白表达的影响

Western Blot结果(图4)显示,与CON组相比,KO组和CKO组TA中PPARγ、pERK的蛋白相对表达量显著上调(P<0.000 1),TA中aP2的蛋白相对表达量亦显著上调(P<0.01);CKO组TA中pAMPK的蛋白相对表达量显著下调(KO组:P<0.05,CKO组:P<0.001);KO组和CKO组TA中pHSL的蛋白相对表达量均显著下调(P<0.01);KO组和CKO组TA中pS6K1的蛋白相对表达量显著上调(KO组:P<0.001,CKO组:P<0.01);KO组和CKO组TA中UCP1的蛋白相对表达量均显著上调(KO组:P<0.000 1,CKO组:P<0.001)。上述结果提示,条件性敲除MC4R基因可能通过调控线粒体能量代谢相关信号通路影响脂肪定向沉积。
图4 TA中敲除MC4R基因对脂代谢相关蛋白表达的影响

A:TA中PPARγ蛋白的Western Blot检测及相对定量分析;B:TA中aP2蛋白的Western Blot检测及相对定量分析;C:TA中pAMPK蛋白的Western Blot检测及相对定量分析;D:TA中pS6K1蛋白的Western Blot检测及相对定量分析;E:TA中pHSL蛋白的Western Blot检测及相对定量分析;F:TA中pERK蛋白的Western Blot检测及相对定量分析;G:TA中UCP1蛋白的Western Blot检测及相对定量分析;H:TA中GAPDH蛋白的Western Blot检测及相对定量分析。

Fig.4 Effects of MC4R gene knockout in TA on expression of lipid metabolism-related proteins

A: Western Blot detection and relative quantification analysis of PPARγ protein in TA; B: Western Blot detection and relative quantification analysis of aP2 protein in TA; C: Western Blot detection and relative quantification analysis of pAMPK protein in TA; D: Western Blot detection and relative quantification analysis of pS6K1 protein in TA; E: Western Blot detection and relative quantification analysis of pHSL protein in TA; F: Western Blot detection and relative quantification analysis of pERK protein in TA; G: Western Blot detection and relative quantification analysis of UCP1 protein in TA; H: Western Blot detection and relative quantification analysis of GAPDH protein in TA.

3 讨论

MC4R作为G蛋白偶联受体超家族的一员,在中枢神经系统中调控采食量和能量平衡,是影响脂肪沉积和肥胖的关键靶点[17]。然而,MC4R在外周骨骼肌中特异性调节肌内脂肪沉积的分子机制尚不明确[18]。本试验通过在小鼠TA中条件性敲除MC4R基因,成功建立了MC4R基因的CKO模型,并证实MC4R基因的缺失解除了对多条代谢通路的抑制,从而导致了肌内脂肪沉积。
肌内脂肪是本研究最终观察到的形态学和生理学结果,是脂肪生成、脂肪合成与脂肪分解代谢共同作用的产物。而造成肌内脂肪沉积的根本驱动力在于脂肪酸合成代谢相对于分解代谢的优势,而这一平衡受细胞能量感应器AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号轴的严格调控[19-21]。AMPK信号通常通过磷酸化ACC来抑制脂肪酸合成[22]。然而,本研究显示,敲除MC4R基因的TA中,pAMPK蛋白相对表达量显著降低,脂肪酸合成限速酶基因ACC和FAS的mRNA相对表达量显著升高,这表明AMPK活性受到抑制后解除了对下游限速酶ACC的负向调控,从而直接驱动了脂肪酸的合成。有研究表明,与AMPK呈拮抗关系的脂合成代谢通路mTOR则表现为pS6K1蛋白相对表达量显著升高[23]。本试验结果与此一致,CKO组小鼠TA中pS6K1蛋白相对表达量显著升高,表明MC4R功能缺失可通过激活脂合成代谢通路mTOR/S6K1,促进脂肪沉积。因此推测,AMPK通路抑制与mTOR通路激活的协同作用使肌肉代谢状态全面转向合成代谢优势,构成了MC4R基因缺失驱动肌内脂肪定向沉积的核心上游机制[24-25]。
同时,本试验还发现,条件性敲除MC4R基因使得TA中脂肪细胞分化的核心转录因子PPARγ和成熟脂肪细胞标志物aP2的蛋白相对表达量显著上调,而PPARγ的激活是脂肪分化的决定性步骤[26]。这表明MC4R基因缺失极大地促进了肌内脂肪祖细胞向脂肪细胞的分化,增加了肌内脂肪细胞的数量。此外,本试验发现,条件性敲除MC4R基因的TA中脂肪分解的关键酶pHSL的蛋白相对表达量显著下调。上述结果提示,MC4R基因缺失不仅促进了脂肪的合成,还同时抑制了脂肪的分解,导致TG的净积累。
此外,本试验还观察到条件性敲除MC4R基因的TA中pERK的蛋白相对表达量显著上调。细胞外调节蛋白激酶(ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的关键成员,其激活可能通过促进脂肪前体细胞的增殖和分化,进一步加剧脂肪沉积[27]。但值得注意的是,尽管存在脂肪积累,条件性敲除MC4R基因的TA中促进脂肪酸氧化的转录因子PPARα的mRNA相对表达量显著升高,以及产热蛋白UCP1的蛋白相对表达量显著升高。由PPARα和UCP1的表达上调推测,TA组织在脂质超载状态下试图通过增强脂肪酸氧化和产热来代偿性清除过量脂质,然而,由于AMPK通路抑制所导致的合成代谢失衡占据了主导地位,这种代偿反应仍不足以阻止脂肪的异常沉积。
综上可知,条件性敲除肌肉中MC4R基因可解除对AMPK通路的抑制,同时激活mTOR、ERK通路,形成了一个多维度的分子机制网络。该网络协同促进了脂肪细胞分化和脂肪合成,同时抑制脂肪分解,最终导致肌肉组织中脂肪定向沉积增加。这些发现不仅阐明了MC4R在肌肉局部调控脂质稳态的关键作用,也为精准调控雪花牛肉的生成提供了重要的理论基础。

4 结论

条件性敲除MC4R基因可增强脂肪细胞的转录分化并调控脂肪酸氧化代谢,引起小鼠肌内脂肪沉积。该结论可为探究雪花牛肉形成机理提供理论参考。

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