畜禽养殖业规模化发展过程中,抗生素滥用引发的病原菌耐药性增强、畜禽产品药物残留超标等问题已引起广泛关注,这不仅制约畜牧产业的可持续发展,还对公共卫生安全与人类健康构成潜在威胁。因此,寻找能够替代抗生素的绿色添加剂已成为重要研究课题[1]。目前国内外关于乳酸菌筛选的研究较多,但部分研究未将肠道黏附性纳入筛选体系,这可能导致筛选出的菌株定植能力较弱,实际应用效果受限。例如古丽帕日·艾克拜等[2]从鸡肠道分离获得唾液乳杆菌、植物乳杆菌与罗伊氏乳杆菌,证实其具备优良的增殖能力及耐酸、耐胆汁等益生特性;张红等[3]从籽鹅肠道筛选得到非解乳糖链球菌,该菌株同样表现出较强的耐酸、耐胆盐与抑菌活性。上述研究均聚焦基础益生特性,未对菌株肠道黏附能力进行探究。已有研究表明,益生菌的肠道黏附性会影响其在消化道内的滞留时间及益生作用的发挥[4-5]。菌体自凝聚率、表面疏水率、与致病菌共凝聚率和生物膜形成能力等非特异性指标常用于评价黏附性能,这主要是由于菌体黏附素与易感宿主细胞表面的相互结合依赖静电作用与疏水作用的共同介导[6]。此外,菌体黏附素的合成与表达受特定基因调控,目前已证实调控乳酸菌黏附能力的关键基因包括胶原黏附素(ace)、肠球菌黏附因子A(efaA)、分选酶C(srtC)和博德特氏菌外膜蛋白D(BopD)等[7],这些基因的表达直接影响菌体的表面疏水率、自凝聚率等表面理化特性指标,表面疏水率及自凝聚率越高,黏附能力越强[8]。龚虹等[9]也指出,乳酸菌的生物膜形成能力、自凝聚率和表面疏水率与菌株的黏附能力呈正相关。李斯淼等[10]从家蚕肠道食糜中分离出黏附性较强的粪肠球菌,其自凝聚率和表面疏水率分别达18%和70%,能够在肠道中定植。乳酸菌因具备调节肠道健康、提升动物生长性能等作用,早已被正式列为动物饲料添加剂[11],但是不同来源乳酸菌生理特性与作用效果存在较大差异,能否耐受胃肠道低pH、高胆盐环境,同时具备良好的肠道黏附能力,是筛选优质饲用乳酸菌的重要依据。基于此,本试验从牛乳中筛选高黏附性乳酸菌,并系统测定其各项益生性能,以期为饲用益生菌制剂的研发提供优质菌种资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样本采集
于河北省某牧场采集健康奶牛新鲜牛乳,放入灭菌管后密封,置于4 ℃保存,用于后续菌株分离。
1.1.2 培养基及主要试剂
MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基、血琼脂基础培养基、MRS-碳酸钙(CaCO3)培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基及细菌微量生化鉴定管均购自青岛海博生物技术有限公司;药敏纸片购自常德比克曼生物科技有限公司;抑菌试验指示菌株金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(ATCC25922)、无乳链球菌(ATCC13813)均购自上海鲁微科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株分离
从灭菌管中吸取1 mL牛乳,接种至已灭菌的100 mL MRS肉汤培养基中,于37 ℃、150 r/min条件下恒温振荡富集培养24 h。采用无菌生理盐水对富集菌液进行倍比稀释,选取10-5、10-6和10-7梯度下的稀释液,各吸取100 μL均匀涂布于MRS-CaCO3培养基表面,37 ℃倒置培养24 h。培养结束后观察菌落生长状态和形态特征,挑取可产生溶钙圈的单个菌落,接种于MRS琼脂培养基上进行分离纯化,获取纯化菌株。
1.2.2 菌株筛选
将纯化菌株转接至8 mL MRS肉汤培养基中,37 ℃、150 r/min振荡培养24 h,然后取菌液点种于血琼脂平板上,培养24 h后,筛选无溶血透明圈的菌株开展后续表面黏附性测定。
1.2.3 表面黏附性测定
1.2.3.1 自凝聚能力
参照Collado等[12]的优化方法测定菌株自凝聚能力。将待测菌液以2 593×g离心10 min,用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌体沉淀2次,调整菌液600 nm波长处吸光度值(OD600 nm)至0.80±0.05(A0),从中吸取4 mL涡旋振荡10 s,37 ℃静置培养4 h,测定OD600 nm(At)。按照下方公式计算菌株自凝聚率:
自凝聚率(%)=(1-At/A0)×100。
1.2.3.2 表面疏水性
参照Rosenberg等[13]的优化方法测定菌株表面疏水性。取2 mL OD600 nm为0.80±0.05(A0)的菌液与2 mL二甲苯1∶1涡旋混匀,37 ℃静置1 h,测定OD600 nm(Af)。按照下方公式计算菌株表面疏水率:
表面疏水率(%)=(1-Af/A0)×100。
1.2.3.3 与致病菌共凝聚能力
参照Del Re等[14]的优化方法测定菌株与致病菌共凝聚能力。采用无菌PBS分别调节金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌液浓度至1×108 CFU/mL,测定OD600 nm(C致病菌);取2 mL OD600 nm为0.80±0.05(C菌株)的菌液分别与2 mL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌液进行涡旋混合,静置2 h,测定OD600 nm(C混合)。按照下方公式计算菌株与致病菌的共凝聚率:
共凝聚率(%)={1-C混合/[(C菌株+C致病菌)/2]}×100。
1.2.3.4 生物膜形成能力
采用96孔微孔板定量法测定菌株生物膜形成能力。将待测菌株37 ℃培养48 h,各移取200 μL菌液加入标准96孔微量滴定板中,其中前3孔加入MRS肉汤培养基作为空白对照;37 ℃恒温培养48 h后,弃去孔内原有培养基,使用无菌PBS洗涤孔板以去除浮游菌体,随后加入甲醛溶液固定30 min,再用无菌PBS去除甲醛并置于37 ℃干燥2 h;每孔加入100 μL 1%结晶紫溶液染色20 min,室温干燥30 min后,各孔分别加入100 μL 95%乙醇,轻轻振荡30 min。使用酶标仪(HD-Q96-JF,山东霍尔德电子科技有限公司)于590 nm波长处测定吸光度值,菌株孔吸光度值记为OD,空白对照孔吸光度值记为OD0。试验重复3次。依据Borges等[15]提出的标准判定菌株生物膜形成能力:OD<OD0为无生物膜形成能力,OD0≤OD<2OD0为弱生物膜形成能力,2OD0≤OD<4OD0为中等生物膜形成能力,OD≥4OD0为强生物膜形成能力。
1.2.4 菌株鉴定
1.2.4.1 形态学观察
选取黏附性能较好的安全菌株,接种于MRS琼脂培养基培养24 h。挑取生长状态良好的单个菌落,采用革兰氏染色法进行镜检,观察菌体的形态特征。
1.2.4.2 生化鉴定
参照细菌微量生化鉴定管使用说明书,对待测菌株进行糖(醇)类发酵、甲基红试验、胆汁七叶苷水解、精氨酸双水解酶等各项生化鉴定试验。
1.2.4.3 分子生物学鉴定
提取待测菌株基因组DNA,采用细菌16S rDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')与1492R(5'-TACGGYTACCTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后,送至北京志超伟业生物技术有限公司完成基因测序,测序结果利用NCBI数据库BLAST程序进行序列同源性比对。
1.2.5 益生特性测定
1.2.5.1 人工胃肠液耐受能力
参照韩佳临[16]的方法配制人工胃液和人工肠液。将待测菌液以2%接种量分别接种至人工胃液、人工肠液及MRS肉汤培养基中,分别取培养前与培养3 h后的菌液,采用稀释涂布平板法计算活菌数。按照下方公式计算菌株在人工胃液和人工肠液中的存活率:
存活率(%)=(培养3 h后的活菌数/培养前的活菌数)×100。
1.2.5.2 抑菌活性
将3种指示菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌)于37 ℃培养24 h后,稀释至106~107 CFU/mL。分别取100 μL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌液涂布于LB营养琼脂培养基上,无乳链球菌菌液则涂布于添加脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂培养基;使用直径0.6 cm的无菌打孔器在平板上均匀打孔,每板设3个孔,各孔分别加入100 μL待测菌液;37 ℃恒温培养24 h后,测量抑菌圈直径(抑菌圈直径=透明圈直径-孔直径)。
1.2.5.3 抗生素敏感性
取100 μL待测菌液均匀涂布于MRS琼脂培养基上,将10种药敏纸片(恩诺沙星、卡那霉素、链霉素、新霉素、红霉素、强力霉菌素、环丙沙星、多黏菌素B、氨苄西林和青霉素)按照梅花状均匀贴附于培养基表面,倒置培养24 h。测定并记录各药敏纸片对应的抑菌圈直径,参照NCCLS[17]标准判断受试菌株的抗生素敏感性。
1.2.5.4 耐胆盐能力
将待测菌液以2%接种量分别接种至不含胆盐(对照)及含0.1%、0.2%、0.3%胆盐的MRS肉汤培养基中,37 ℃培养24 h后进行稀释涂布平板计数,计算菌株存活率。菌株存活率计算公式为:
存活率(%)=(试验组活菌数/对照组活菌数)×100。
1.2.5.5 耐高温能力
将待测菌液以2%接种量接种至MRS肉汤培养基中,分别置于37(对照)、40、43和46 ℃水浴培养15 min,然后进行稀释涂布平板计数,菌株存活率计算方法同1.2.5.4。
1.2.5.6 耐酸能力
将MRS肉汤培养基的pH分别调至3.0、4.0和5.0,以pH为5.7±0.2的常规MRS肉汤培养基为对照,将待测菌液以2%接种量分别接入不同pH培养基,37 ℃培养3 h后进行稀释涂布平板计数,菌株存活率计算方法同1.2.5.4。
1.3 数据统计分析
采用SAS 9.4软件对试验结果进行单因素方差分析,并采用Duncan氏法进行组间多重比较,结果以“平均值±标准误”表示,P<0.05表示差异显著。使用GraphPad Prism 9.5软件绘图。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离与筛选
2.2 菌株表面黏附性测定结果
为探究上述6株安全菌株(A、B、C、D、E和F)的菌体表面黏附性,本研究测定了其自凝聚能力、表面疏水性、与致病菌共凝聚能力及生物膜形成能力。如图3-A所示,6株菌株的自凝聚率介于17.04%~66.73%,其中菌株A、F的自凝聚率分别为66.73%、61.34%,显著高于其他菌株(P<0.05)。如图3-B所示,菌株B的表面疏水率最高,达42.49%;菌株C的表面疏水率最低,为11.03%。与致病菌共凝聚能力测定结果(图3-C和图3-D)显示,6株菌株与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的共凝聚率分别高于75%、78%,对2种致病菌均具备较强共凝聚能力。菌株培养48 h后的生物膜形成能力见表1,结果显示,所有菌株均具有一定的生物膜形成能力,其中菌株A、C、D成膜能力更为突出。综合各项菌体表面黏附性相关指标,最终筛选黏附性能优异的菌株A开展后续菌种鉴定与益生特性研究。
图3 菌株表面黏附性数据柱形标注不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。 Fig.3 Surface adhesion of strains Value columns with different letters mean significant difference (P<0.05), while with the same letters mean significant difference (P>0.05). The same as below. |
表1 菌株生物膜形成能力Table 1 Biofilm-forming ability of strains |
| 菌株 Strains | 生物膜形成能力 Biofilm-forming ability |
|---|---|
| A | ++ |
| B | + |
| C | ++ |
| D | ++ |
| E | + |
| F | + |
“++”表示强生物膜形成能力;“+”表示中等生物膜形成能力。 | |
“++” means strong biofilm-forming ability; “+” means moderate biofilm-forming ability. |
2.3 菌株鉴定结果
2.3.1 形态学观察
由图4革兰氏染色结果可知,菌株A菌体呈蓝紫色,形态为球状,属于革兰氏阳性菌。
2.3.2 生化鉴定
由表2可知,菌株A能够酵解葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等多种糖类,也可分解甘露醇和山梨醇,且精氨酸双水解酶试验、胆汁七叶苷水解试验及甲基红试验均为阳性,触酶试验为阴性。结合革兰氏染色特征与各项生化反应结果,初步判定菌株A为乳酸菌。
表2 菌株A的生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results of strain A |
| 项目 Items | 鉴定结果 Identification results | 项目 Items | 鉴定结果 Identification results | |
|---|---|---|---|---|
| 葡萄糖Glucose | + | 甲基红试验Methyl red test | + | |
| 蔗糖Sucrose | + | 胆汁七叶苷水解试验 Bile esculin hydrolysis test | + | |
| 乳糖Lactose | + | 精氨酸双水解酶试验 Arginine dihydrolase test | + | |
| 半乳糖Galactose | + | 硝酸盐还原试验Nitrate reduction test | - | |
| 麦芽糖Maltose | + | 明胶液化试验Gelatin liquefaction test | - | |
| 阿拉伯糖Arabinose | + | 吲哚试验Indole test | - | |
| 甘露醇Mannitol | + | 触酶试验Catalase test | - | |
| 山梨醇Sorbitol | + |
“+”表示阳性;“-”表示阴性。 | |
“+” means positive; “-” means negative. |
2.3.3 16S rDNA鉴定
图5 菌株A的基因组DNA电泳图M:DL2000 DNA标记物 DL2000 DNA marker;A:菌株A strain A。 Fig.5 Electrophoresis pattern of genomic DNA of strain A |
2.4 菌株益生特性测定结果
2.4.1 人工胃肠液耐受能力
粪肠球菌A在人工胃肠液中的存活率如图7所示,其在人工胃液中的存活率为94.52%,而在人工肠液中存活率为152.41%,且在人工肠液中的存活率显著高于人工胃液(P<0.05),表明该菌对人工胃肠液均具有良好的耐受性。
2.4.2 抑菌活性
粪肠球菌A对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的抑菌效果如图8所示,该菌对所有供试菌株均形成了明显的抑菌圈,抑菌圈直径分别为8.13(金黄色葡萄球菌)、7.50(大肠杆菌)和6.13 mm(无乳链球菌),其中对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径显著大于无乳链球菌(P<0.05)。
2.4.3 抗生素敏感性
粪肠球菌A对10种抗生素的敏感性结果如图9所示,其对恩诺沙星、红霉素、氨苄西林、环丙沙星、强力霉菌素和青霉素均具有敏感性,对卡那霉素、链霉素、新霉素和多黏菌素B均不敏感。其中,对恩诺沙星、氨苄西林、强力霉菌素和青霉素呈高度敏感;对红霉素和环丙沙星呈中度敏感。
图9 粪肠球菌A的抗生素敏感性S:高度敏感 highly sensitive;I:中度敏感 moderately sensitive;R:不敏感 insensitive;ENR:恩诺沙星 enrofloxacin;ERY:红霉素 erythromycin;AMP:氨苄西林 ampicillin;CIP:环丙沙星 ciprofloxacin;DO:强力霉菌素 doxycycline;PEN:青霉素 penicillin;KAN:卡那霉素 kanamycin;STR:链霉素 streptomycin;NEO:新霉素 neomycin;PB:多黏菌素B polymyxin B。 Fig.9 Antibiotic susceptibility of Enterococcus faecalis A |
2.4.4 耐胆盐能力
粪肠球菌A在不同胆盐浓度条件下的存活率如图10所示,在胆盐浓度为0.1%~0.3%时,粪肠球菌A的存活率为27.39%~46.93%,且随着胆盐浓度的提高,粪肠球菌A存活率下降,其在0.1%和0.2%胆盐条件下的存活率显著高于0.3%胆盐条件下(P<0.05)。
2.4.5 耐高温能力
粪肠球菌A在不同温度条件下的存活率如图11所示,其在40~46 ℃时的存活率均高于90%,40 ℃时存活率最高,达99.96%,说明该菌株可耐受一定高温环境。
2.4.6 耐酸能力
3 讨论
乳酸菌是动物肠道微生物菌群的重要组成部分,具有多种益生特性。从自然界分离获得的乳酸菌大多数被认为是安全菌株,但仍存在部分菌株可诱发溶血性疾病,威胁动物健康。本试验通过溶血试验从健康奶牛牛乳中筛选出6株无溶血活性的疑似乳酸菌菌株。鉴于乳酸菌的益生效果与其在肠道的黏附性密切相关[18],本研究进一步测定了6株安全菌株的表面黏附性指标。测定结果表明,菌株A的自凝聚率为6株菌中最高,达66.73%,属于高自凝聚能力菌株,且其表面疏水率为27.40%,疏水能力处于中等水平。有研究指出,菌株疏水能力能够在一定程度上反映其非特异性黏附能力的强弱[19]。刘东方等[20]研究发现,菌株表面疏水率越高,黏附宿主细胞的数量越多。Zhang等[21]从牛乳中分离出了表面疏水率为36%(中等疏水能力)和70%以上(强疏水能力)的乳酸菌,说明同源乳酸菌表面疏水性仍存在显著个体差异。本试验筛选出的菌株A还具备优异的与致病菌共凝聚能力,其与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的共凝聚率分别为85.35%、81.98%。宋晨[22]测定猫源肠球菌共凝聚能力发现,11株试验菌株的共凝聚率为16.79%~55.58%,整体低于本试验测定结果。Todorov等[23]研究表明,乳酸菌共凝聚能力越强,菌体细胞黏附率越高。乳酸菌的黏附能力与其功能性基因表达密切相关,多种毒力及黏附相关基因可协同调控菌株表面黏附与定植过程,其中ace、efaA、丝氨酸蛋白酶基因(sprE)和明胶酶基因(gelE)为关键调控基因。已有研究证实,粪肠球菌中ace基因编码的胶原黏附素可通过参与生物膜形成显著增强菌株黏附性能[24],同时菌株菌毛作为重要黏附介质,可加快菌体与宿主肠道上皮的黏附定植,是菌株实现肠道稳定定植的核心因素。丁诗瑶[25]通过测定乳酸菌的表面疏水率、自凝聚率、共凝聚率和细胞黏附性,从12株牛乳源乳酸菌中筛出2株高黏附性乳酸菌;Krausova等[26]通过表面疏水率和自凝聚率测定,分离出对模拟肠黏膜的混合细胞培养物黏附率为37.2%的乳酸菌,这些菌株对改善肠道的消化吸收功能具有潜在价值。本试验筛选出的菌株A兼具高自凝聚能力、与致病菌共凝聚能力及强生物膜形成能力,证实该菌株具备优异的表面黏附潜能。
本试验筛选得到的高黏附菌株A,经形态学观察、生化特征检测及16S rDNA分子鉴定,确定为粪肠球菌。粪肠球菌作为一种乳酸菌,已被批准可应用于饲料微生物添加剂[27],具有增强机体免疫力、调节肠道菌群平衡[28]、调控脂肪代谢[29]和提高动物生产性能[30]等作用。本试验结果表明,粪肠球菌A在人工胃液与人工肠液中存活率均高于90%,说明该菌株符合在动物肠道内定植的基本条件。有报道指出,粪肠球菌可通过分泌抑菌活性物质抑制肠道致病菌增殖,亦可与致病菌形成营养竞争与生态拮抗,有效降低动物肠道疾病发生率[31]。本研究中体外抑菌试验结果显示,粪肠球菌A对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌的抑菌圈直径分别为8.13、7.50、6.13 mm,表现出一定的抑菌活性。王佳慧等[32]通过体外益生试验也发现,粪肠球菌BN6对大肠杆菌、变形杆菌和沙门氏菌等8株肠道致病菌均具有抑制作用。抗生素敏感性测定是益生菌饲料应用潜力评价的核心指标,也是菌株益生特性综合评估的重要依据[33]。本研究分离的牛乳源粪肠球菌A具有较广泛的药物敏感性,对恩诺沙星、氨苄西林、环丙沙星、多西环素、青霉素等常用抗生素均表现出敏感性。畜禽胃肠道内低pH环境与高浓度胆盐易破坏益生菌细胞膜结构,因此耐酸、耐胆盐是益生菌在肠道内定植并发挥益生作用的重要抗逆特性[34-35]。不同畜禽消化道胃液pH存在明显差异,猪胃液pH为3.5~5.0,鸡胃液pH为2.5~4.0,反刍动物真胃胃液pH低至2.0~3.0,但随着动物的采食,胃液pH将会发生不同程度的升高。有报道指出,益生菌在pH 3.0条件下存活1.5~2 h可作为判定其耐受低pH的标准[36]。本试验中粪肠球菌A在pH 3.0条件下处理3 h后的存活率为18.86%,与宋晨[22]的研究结果相近,其分离的粪肠球菌可耐受酸性环境(pH 3.0)及0.3%胆盐条件。本试验进一步测定发现,粪肠球菌A在0.3%胆盐条件下的存活率为27.39%,与王佰涛等[37]筛选的粪肠球菌SWS50在同等胆盐浓度下的存活率(33.75%)处于相近水平。动物消化道内天然胆盐浓度多集中在0.1%~0.3%,具备益生潜力的乳酸菌耐受胆盐临界浓度普遍为0.3%[38]。由此可见,粪肠球菌A对胆盐表现出一定耐受性,能够在畜禽胃肠道内存活。李瑞等[39]发现约氏乳杆菌在pH 3.0条件下存活时长不足2 h;卢博雨等[40]也发现唾液乳杆菌在0.3%胆盐条件下生长基本停滞。与之相比,本试验筛选的粪肠球菌A可在pH 3.0酸性条件下存活3 h以上,这验证了粪肠球菌对酸性和高胆盐等恶劣条件有较强的适应能力[41]。此外,粪肠球菌对生长条件要求较低。本试验中的粪肠球菌A在46 ℃条件下存活率高达92.64%,这与潘俊歆等[42]的研究结果相符,其研究发现粪肠球菌可耐受45~50 ℃高温。综上可知,本试验筛选的粪肠球菌A兼具优异的肠道黏附能力和一定益生特性,可为畜禽高效益生菌制剂的研发提供参考。
4 结论
本试验从健康奶牛牛乳中分离出1株具有较高自凝聚率、共凝聚率和较强生物膜形成能力的粪肠球菌A,该菌株对人工胃肠液和高浓度胆盐具有较强的耐受性,同时具有耐高温和中等抑菌能力。