牛奶富含优质蛋白质、脂质、钙及维生素等多种营养物质,在提供能量与促进骨骼健康等方面具有不可替代作用[1]。牛奶中蛋白质及活性肽(如乳铁蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白糖巨肽)具有免疫调节、改善肠道健康、促进矿物质吸收及抗菌、抗氧化等多重功效,且脂质中的乳脂肪球膜能促进婴幼儿神经发育并改善认知功能。其他生物活性物质如骨桥蛋白、激素和生长因子等,在促进骨骼健康、调节生长发育以及参与乳腺自身保护与分化等过程中扮演着重要角色[2]。目前,我国规模化牧场的生鲜乳核心品质已达到国际先进水平,乳蛋白和乳脂肪平均含量分别达3.3%和3.8%,菌落总数、体细胞数等关键卫生指标优于欧盟标准。大部分牧场奶牛年均单产普遍超过10 t,为生产高品质乳制品提供了坚实基础[3]。新国标明确要求灭菌乳必须100%使用生鲜乳,禁用复原乳,这一规定从法规层面推动了奶源品质的全面升级,并持续扩大了其对优质生鲜乳的需求[4]。然而,目前我国在奶酪、黄油等干乳制品及乳清蛋白等高值原料的精深加工技术上仍存在瓶颈,相当程度依赖进口[5]。
通过基因层面的精准解析与靶向改良,从根本上定向优化关键乳成分(乳蛋白和乳脂肪)的组成和含量,已成为突破产业瓶颈、提升乳品质的关键路径和研究前沿。乳成分性状是牛奶质量和奶牛育种的核心指标,受微效多基因控制[6]。随着前沿生物技术的发展,奶牛乳成分性状的遗传调控研究已从单一基因筛选转向多组学整合分析,系统解析基因互作网络与关键非编码调控元件功能,可全面揭示其遗传基础[7]。编码基因作为乳成分性状遗传基础的核心,直接参与并主导乳脂、乳蛋白等关键成分的生物合成与分泌过程。编码基因表达水平与序列多态性显著影响乳蛋白和乳脂肪的组成和含量,其遗传变异可作为重要的分子标记用于育种选择。非编码基因曾被视为无功能的“基因组暗物质”,但其在牛关键乳成分调控中的重要性逐渐被揭示。这些非编码RNA等功能分子通过染色质相互作用、信号通路激活或表观修饰等机制,精准调控乳蛋白和乳脂肪合成相关基因的表达,突破了传统编码基因主导的研究框架[8]。基于此,本文深度解析了基因及其多态性对奶牛乳蛋白和乳脂肪的调控作用,旨在揭示上述多层级调控因素通过调节下游分子、最终决定泌乳表型的核心调控通路,从而为乳蛋白和乳脂肪的基因解析与精准调控奠定理论基础,并为其向产业应用转化开辟新路径。
1 编码基因对乳蛋白和乳脂肪合成的影响
1.1 编码基因对乳蛋白合成的影响
牛乳中蛋白质含量约占其总量的3.4%,主要由酪蛋白(casein,CSN)和乳清蛋白组成,CSN约占总蛋白质的80%,CSN家族(包括CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3)是乳蛋白的核心成分,其编码基因的表达直接决定乳蛋白的组成和含量[9]。代文婷[10]整合转录组学与蛋白质组学发现,奶牛乳腺中丝氨酰-转运RNA合成酶(serine-tRNA synthetase,SARS)通过调控蛋氨酸(methionine,Met)代谢网络,显著影响CSN合成效率。Met经氨基酸载体丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体2进入乳腺细胞后,可显著上调SARS的表达,激活后的SARS可通过增强哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路,提升转录激活因子5活性,从转录与翻译2个层面协同促进CSN的合成。研究还发现,SARS基因沉默会引发细胞内蛋白质降解加剧,而补充Met则通过抑制非阻遏蛋白2信号通路缓解因氨基酸饥饿所造成的代谢应激,从而维持CSN合成稳态[11]。该研究系统性地揭示了宿主基因(如SARS)通过响应并整合关键氨基酸信号来精细调控乳蛋白合成的分子网络,为通过靶向氨基酸营养策略提升乳蛋白产量提供了重要理论依据。L型氨基酸转运载体1(L-type amino acid transporter 1,LAT1)是奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,bMECs)摄取必需氨基酸的关键分子,其通过介导亮氨酸、缬氨酸等支链氨基酸的跨膜转运,激活mTOR复合物1-核糖体蛋白S6激酶信号轴,从而上调CSN2表达,同时抑制真核翻译起始因子4E结合蛋白1对翻译起始的负调控作用,进而协同促进乳蛋白合成[12]。进一步研究表明,亮氨酸还可通过增强CSN2基因启动子区组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰促进染色质开放,提升其转录效率,最终促进乳蛋白合成[13]。该研究揭示了LAT1与亮氨酸通过信号传导与表观遗传双重途径精确调控CSN2表达的机制,丰富了宿主基因影响乳蛋白合成的调控层次。综上所述,宿主基因通过“氨基酸感知-信号传导-表观修饰”的级联通路,实现了对乳蛋白合成的精密调控,从而在分子层面奠定了提升乳蛋白产量的理论基础。
1.2 编码基因对乳脂肪合成的影响
在奶牛生产性能指标中,乳脂肪的权重在不同国家间存在差异,介于6%~25%,凸显了乳脂肪在评估生产性能中的重要性[14]。奶牛的乳脂肪合成涉及复杂的调控网络,包括脂肪酸(fatty acid,FA)的从头合成,血液中长链脂肪酸(long-chain fatty acids,LCFA)的摄取、转运与去饱和作用,甘油三酯(triglyceride,TG)合成以及脂滴分泌[15]。研究发现,磷脂酰肌醇4-激酶2α(phosphatidylinositol 4-kinase type 2 alpha,PI4K2A)基因在奶牛乳脂肪代谢的多个关键阶段发挥积极的正向调控作用,PI4K2A通过显著上调脂肪酸结合蛋白3的表达,促进LCFA的胞内转运;PI4K2A还可通过上调核心转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)γ激活下游FA从头合成关键酶的表达[16],证明PI4K2A可从“外源摄取”和“内源合成”双重途径保障FA合成原料的充足供应,从而显著提高乳脂肪产量。此外,PI4K2A可上调酰基辅酶A氧化酶1,促进FA的β-氧化,为高强度的脂肪合成提供必要的腺苷三磷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[17]。在乳脂肪合成终端,PI4K2A直接上调TG合成的限速酶二酰基甘油O-酰基转移酶1(diacylglycerol O-acyltransferase 1,DGAT1)表达,并抑制脂肪分解关键酶脂肪甘油三酯脂肪酶活性[18],从而通过“促进合成”与“抑制分解”2个方向协同作用,高效驱动乳腺细胞中TG的净积累与脂滴分泌,最终实现乳脂肪产量的显著增加。采用RNA干扰技术敲低bMECs中的真核翻译延伸因子1δ(eukaryotic translation elongation factor 1 delta,Eef1d)基因表达,发现细胞出现脂滴形成异常,且乳汁中TG含量显著下降37.7%。机制研究揭示出Eef1d通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路,促进细胞增殖与乳腺发育,并抑制脂肪分解;同时调节蛋白质翻译与脂肪代谢相关酶活性,并强化PPAR信号通路,驱动下游脂肪合成关键基因表达[19]。以上3条通路在Eef1d的协调下最终形成高效的调控网络,共同促进乳脂肪合成。综上所述,宿主基因通过调控关键信号通路与核心代谢物水平驱动乳脂肪合成是奶牛乳腺乳脂肪代谢调控的关键分子节点,对提升乳脂肪产量与品质发挥积极作用。
2 非编码基因对乳蛋白和乳脂肪合成的影响
2.1 非编码基因对乳蛋白合成的影响
早期人们认为非编码基因如启动子、增强子、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)和小干扰RNA等因缺乏蛋白质编码功能而被归为“基因组的暗物质”[20]。随着高通量测序和功能基因组学技术的突破,这些非编码元件被证实可通过多层次调控网络显著影响牛奶品质[21]。非编码DNA对奶牛产奶量的遗传贡献度高达69%,远超编码基因[22]。最近研究发现,一种与乳腺增殖相关的新型lncRNA(mammary gland proliferation-associated lncRNA,MGPNCR)在bMECs缺乏Met时,其表达显著上调。MGPNCR可与真核翻译起始因子4B(eukaryotic translation initiation factor 4B,eIF4B)直接结合,促进eIF4B蛋白的去磷酸化失活,从而抑制全局蛋白质翻译起始[23]。然而,补充Met二肽时可有效抑制MGPNCR,从而重启并增强蛋白质翻译起始,最终将上游的氨基酸信号有效转化为乳蛋白合成的增加。此外,研究揭示由苜蓿来源的mtr-miR156a可经外泌体跨物种转运至bMECs,调节乳蛋白的合成路径,其机制为mtr-miR156a通过直接靶向并抑制磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基2和蛋白磷酸酶2调节亚基B’δ表达,从而解除其对PI3K-Akt-mTOR核心信号通路的抑制作用,而该信号通路的激活可显著促进下游一系列基因(如蛋白激酶B1、mTOR、eIF4E等)的表达,最终有效驱动主要CSN编码基因(CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3)的转录表达,从转录层面显著提升α-、β-和κ-CSN含量[24]。该研究首次证实了植物源miRNA能够通过外泌体实现跨物种转运,并直接调控奶牛乳蛋白的合成,该发现为通过选育特定牧草等精准干预策略提升乳成分合成提供了明确的分子靶点,具有重要的应用前景。以上研究结果不仅深入阐释了乳蛋白合成的复杂生物学机制,更为未来从基因调控与遗传改良方向优化奶牛乳成分及品种改良研究提供了全新的理论视角。
2.2 非编码基因对乳脂肪合成的影响
环状RNA(circRNA)是一类特殊的新型内源性非编码RNA,通过与蛋白质结合发挥“miRNA海绵”作用,从而诱导多种生物学过程,在乳脂肪合成中发挥关键作用[25]。circRNA-006258和circRNA-016910均通过吸附miR-574-5p,分别调控绵羊和山羊乳腺上皮细胞中的TG合成,以及通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/mTOR信号通路促进β-CSN和TG分泌,进而提升乳脂肪合成率[26-27]。这一调控网络在奶牛中更为系统,研究发现bta-miR-2285f通过抑制钙结合蛋白39(CAB39)的表达,激活mTOR、PI3K-Akt等多个与细胞生长、增殖和脂肪合成密切相关的信号通路,为乳脂肪合成创造了有利的细胞内环境。bta-miR-2285f还可上调脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、PPARγ、脂肪酸转运蛋白6和脂肪酸延长酶6等乳脂肪合成的关键功能基因表达,共同驱动乳脂肪合成[28]。此外,Feng等[29]通过比较泽西牛(高产奶量)与克什米尔牛(低产奶量)bMECs中的circRNA表达谱,鉴定出的关键circRNA构成了从原料供应到终产物合成的完整通路,其中circ_0001122通过吸附miR-22-3p解除其对靶基因脂肪酸转运蛋白和脂肪酸延伸酶的抑制作用,从而调控LCFA的合成与转运,为乳脂肪生成提供前体物质;circ_0007367通过靶向miR-2466-5p正向调控磷脂酸合成酶的表达,进而增强细胞内TG组装与脂滴积累;而circ_0015179通过吸附miR-103/107解除了对靶基因昼夜运动输出周期蛋白的抑制,从而激活参与脂肪合成与葡萄糖代谢的基因网络。上述研究非编码基因的价值不仅在于揭示新的调控靶点,更在于其通过调控信号通路、吸附miRNA及参与代谢网络,为系统性地协同靶向多个分子节点,全方位提升乳成分提供了全新干预逻辑。
3 基因多态性对乳蛋白和乳脂肪合成的影响
3.1 基因多态性对乳蛋白合成的影响
基因多态性作为影响奶牛乳成分的核心遗传枢纽,通过调控乳腺发育、营养物质代谢及乳汁合成关键酶活性等,从根本上决定了乳成分合成的个体差异。β-CSN是牛奶中4种主要CSN之一,约占牛奶总蛋白质的35.7%,有A1、A2和A3等多种形式,其中A2型与改善消化相关[30]。κ-CSN约占牛奶总蛋白质的12.8%,在其不同遗传变异(即基因型)中,携带BB基因型(该基因位点为B等位基因的纯合组合)的奶牛所产牛奶的脂肪和蛋白质含量更高,凝乳速度更快,且奶酪产量也高于其他基因型;而携带EE基因型(该基因位点为E等位基因的纯合组合)的奶牛所产牛奶几乎不会凝结,因此被认为是奶酪加工中最不理想的基因型[31]。研究表明,κ-CSN基因型为AB(该基因座上A与B等位基因的杂合组合,占比30.9%)的荷斯坦公牛,其母亲和后代的产奶量和乳蛋白率显著高于AA基因型(该基因座上A等位基因的纯合组合),揭示了B等位基因的引入通过优化κ-CSN的胶束稳定功能,有效提升乳腺合成与分泌效率。β-CSN基因型为A2A2(该基因座上A2等位基因的纯合组合,占比20.6%)公牛的母亲表现出最高的产奶量(14 482 kg),且该基因型能稳定遗传,使其后代的产奶量和乳蛋白率显著增加[32],凸显出A2等位基因是提高产奶量与蛋白质产量的关键遗传因子,而这些关键等位基因功能的明确,为通过分子标记辅助选择来定向提升牛群优良等位基因频率提供了直接依据,从而系统性地实现牛群产奶性能与乳成分的协同改良。牛体内的亮氨酸氨肽酶3(leucine amino peptidase 3,LAP3)位于6号染色体上,是一种外肽酶,能够精确切除较短肽链中的亮氨酸残基[33]。研究发现,LAP3基因的多态性是乳品质的重要候选基因,其中位于LAP3基因的g.4494G>A和g.5919A>G单核苷酸多态性(SNP)位点与蛋白质含量显著相关,且纯合子基因型蛋白质含量显著高于杂合子。这些位点的优势等位基因(如A或G)可能通过增强LAP3基因的转录或翻译效率,优化乳腺细胞内蛋白质代谢与分泌通路的整体流量,从而提升总蛋白质的合成与分泌效率,表现为加性遗传效应[34]。g.8033G>C位点与CSN和蛋白质含量显著相关,其中CC基因型(该基因座上C等位基因的纯合组合)水平显著高于GG(该基因座上G等位基因的纯合组合)和GC基因型(该基因座上G与C等位基因的杂合组合)[35]。CC基因型的优势可能上调了LAP3的活性,进而特异性地促进CSN微粒等大型复合物的组装与分泌,最终有效提高CSN等乳蛋白含量。
3.2 基因多态性对乳脂肪合成的影响
脂质含量与组成是衡量乳品营养健康价值的核心指标,并直接决定其经济价值。基因多态性是导致乳脂肪含量与组成变异的重要遗传基础,不同基因型通过影响脂肪合成关键通路,最终决定乳汁的脂肪性状。蛋白激酶环磷酸腺苷-激活的催化亚基α(protein kinase cAMP-activated catalytic subunit alpha,PRKACA)定位于牛7号染色体,主要富集在胆汁分泌、胰岛素信号通路和脂肪细胞中脂肪分解调节等脂质代谢相关信号通路中发挥作用。研究发现,PRKACA基因g.11592189C>T位点对乳脂量的加性效应、显性效应和替代效应在第1和第2泌乳期均达到极显著[36]。此外,在PRKACA基因5’调控区的SNP位点突变前后,预测到Krüppel样因子15、Krüppel样因子2和锌指蛋白692等5个与脂肪代谢调节相关的转录因子结合位点发生改变,推测这些转录因子可能通过提升PRKACA基因的转录水平,进而显著促进乳脂肪生成。近期研究证实,DGAT1的K232A多态性仍是乳脂肪合成的核心调控位点,其AA基因型可显著提高乳脂率,但可能伴随产奶量下降[37]。硬脂酰-辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)基因的g.10329C>T位点与乳中不饱和脂肪酸比例显著相关,对功能性乳制品开发具重要应用潜力[38]。以上发现明确了DGAT1和SCD1在乳脂肪合成效率和组成中发挥重要作用,并揭示了遗传变异对乳成分形成的调控作用,为深入解析乳品质差异的分子基础提供了关键证据。酰基-辅酶A氧化酶2(acyl-CoA oxidase 2,ACOX2)作为乳脂肪代谢的关键参与者,是β氧化支链脂肪酸的限速酶,催化LCFA氧化为短链脂肪酸,被鉴定为影响乳品质的重要候选基因[39]。通过对中国荷斯坦奶牛ACOX2基因的整个编码区及上、下游各2 000 bp侧翼序列测序,共鉴定出5个SNP位点,这些位点在第2泌乳期与产奶量和乳脂率等性状显著相关,其中SNP rs209677248对乳脂率的表型变异贡献率高达4.90%,提示其具有重要的育种价值。此外,生物信息学分析提出了一个关键的调控假说,即位于5'非翻译区(5'UTR)的SNP rs109066086,其T等位基因可能形成转录因子核受体亚家族2C组成员2和转录因子AP-4的DNA结合位点,影响ACOX2基因转录效率,进而通过调节其编码的酶蛋白的丰度与活性,最终影响其驱动的脂肪酸氧化代谢流,改变乳脂肪合成的前体供应[40]。以上研究揭示了基因多态性可通过改变关键代谢酶的基因表达调控,直接影响其编码产物的丰度与活性,从而精细调控乳脂肪合成的代谢网络,为从分子层面深入解析乳脂肪合成的遗传调控本质及实施分子标记辅助选择提供了关键的机制依据。
4 小结
乳蛋白和乳脂肪等关键乳成分作为奶牛核心经济性状,直接决定产奶效益与养殖业的可持续发展。目前研究已明确一系列编码基因通过PI3K-Akt、mTOR、PPAR及MAPK等核心信号通路协同调控乳蛋白和乳脂肪合成,其中FASN、CSN1S1等被识别为关键枢纽基因,而非编码基因及调控元件的精细调控功能日益凸显,与编码基因共同构成复杂的转录网络。全基因组关联研究已鉴定出大量与乳成分显著相关的SNP位点,为分子标记辅助选择提供了直接靶点。然而,目前研究除DGAT1等少数主效基因外,多数遗传变异的精确调控机制尚不清晰,从关键基因到最终表型的完整调控网络,特别是编码与非编码元件的互作关系,有待在更多群体中系统解析。因此,未来研究亟待通过多组学等前沿技术,在深入解析上述关键调控网络的基础上,结合体内分子功能验证,从而协同提升奶牛乳蛋白和乳脂肪等乳成分性状,驱动养殖业向更精准、可预测的系统调控模式推进。