Chinese Journal of Animal Nutrition >

2026 , Vol. 38 >Issue 8: 6342 - 6350

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.506

RESEARCH PAPER

Determination of 3-Nitrooxypropanol Content in Feed Additive and Premix by Ultra-Performance Liquid Chromatography

  • ZHAN Mengying ,
  • DONG Wei , * ,
  • REN Mengmeng ,
  • XING Liwei ,
  • WANG Shikui
Expand
  • DSM (China) Animal Nutrition Research and Development Co., Ltd., Langfang 065700, China
*E-mail:

Received date: 2025-12-30

  Online published: 2026-08-13

Fold

Abstract

This study aimed to establish a detection method for the 3-nitrooxypropanol (3-NOP) content in feed additive and premix by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). Three batches of 3-NOP feed additive (containing 10% 3-NOP, with silicon dioxide as the carrier) and three kinds of 3-NOP premix (containing 0.50%, 0.75% and 1.00% 3-NOP, respectively, with rice chaff as the carrier) were selected. Samples were extracted using acetonitrile and water, and separated by Thermo Accucore Polar chromatographic column. The eluting was further carried out by gradient elution with 0.1% methanesulfonic acid aqueous solution and 20% acetonitrile mobile phase at a flow velocity of 0.20 mL/min, with a column temperature of 25 ℃, an injection volume of 1.6 μL, a detection wavelength of 210 nm, and quantification was performed using the external standard method. The results show that the linear range of 3-NOP detection was 1 to 200 μg/mL [coefficient of determination (R2)=0.999 6], the limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were 40 and 150 mg/kg, respectively, the extraction efficiency was greater than 99%, the relative standard deviation (RSD) was 0.06% to 0.63%, and the recovery ranged from 99.74% to 101.97%. In conclusion, the UPLC method established in this study can be used to rapidly, efficiently and accurately detect the 3-NOP content in feed additive and premix, and has good application value for the evaluation of 3-NOP products.

Key words： UPLC; 3-NOP; quantification; feed additive; premix

Cite this article

ZHAN Mengying , DONG Wei , REN Mengmeng , XING Liwei , WANG Shikui . Determination of 3-Nitrooxypropanol Content in Feed Additive and Premix by Ultra-Performance Liquid Chromatography[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2026 , 38(8) : 6342 -6350 . DOI: 10.12418/CJAN2026.506

反刍动物甲烷(CH4)的排放既会造成饲料能量的浪费,又会加剧全球变暖[1]。CH4是反刍动物瘤胃厌氧发酵的天然产物,是仅次于二氧化碳(CO2)的第二大温室气体;同时,CH4又是一种强有力的温室气体,其全球升温潜能值是CO2的21倍[2]。随着世界各国向2050年实现“温室气体零排放”目标的迈进,反刍动物生产中减少胃肠道CH4排放的压力越来越大[3]。CH4排放对环境的影响不言而喻,因此在畜牧业生产中减少CH4排放对实现“碳中和”意义重大。近年来,3-硝基氧基丙醇(3-nitrooxypropanol,3-NOP)作为一种有效的CH4生成抑制剂引起行业关注。研究显示,3-NOP在推荐剂量下可使奶牛和肉牛的CH4排放量分别降低约30%和45%,且研究人员采用毒药物动力学评估了3-NOP在反刍动物体内的吸收、代谢和排泄特征,证实其可安全应用于反刍动物生产,且不会引起畜产品中期代谢物的残留[4-7]。不过,不同产品中3-NOP含量存在差异,导致其CH4减排效果也不尽相同。因此,本研究基于超高效液相色谱(UPLC)技术,旨在建立一种可靠、快速的检测方法,用于精准测定饲料添加剂和预混料中3-NOP含量,为3-NOP在目标产品中的定量评定提供技术支撑,进而为畜牧业CH4减排技术的推广应用和效果验证提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

3-NOP标准品购于英国LGC公司(生产批号:DRE CA 16405320),纯度为98.4%;色谱级乙腈购于Sigma公司,纯度≥99.9%;甲烷磺酸购于上海麦克林生化科技股份有限公司,纯度≥99.5%;乙酸乙酯购于上海泰坦科技股份有限公司,纯度≥99.5%。
饲料添加剂:选取3批3-NOP饲料添加剂,分别记为添加剂1、添加剂2和添加剂3,每批均定量为10%的3-NOP,载体为二氧化硅(SiO2)。预混料:以砻糠为载体,添加不同质量的目标添加剂,制备3种3-NOP预混料,分别记为预混料1(含0.50% 3-NOP)、预混料2(含0.75% 3-NOP)和预混料3(含1.00% 3-NOP)。饲料添加剂和预混料均由帝斯曼-芬美意公司提供。

1.2 试验主要仪器

UPLC仪(H-Class,Waters,美国),色谱柱(Thermo Accucore Polar,50 mm×2.1 mm,2.6 μm);超声波清洗机(KQ-400DE,昆山市超声仪器有限公司);高速冷冻离心机(D-37520,Thermo Fisher,美国);电子天平[MS3002S,梅特勒托利多科技(中国)有限公司]。

1.3 3-NOP标准储备液和标准工作液配制

精确称量3-NOP标准品50 mg于50 mL容量瓶中,用20%乙腈定容,即配制成1 000 mg/L的3-NOP标准储备液;将1 000 mg/L 3-NOP标准储备液用20%乙腈分别稀释成1、5、10、20、50、100、200和1 000 μg/mL系列标准工作液。

1.4 流动相配置

流动相A为0.1%甲磺酸水溶液;流动相B为80%水+20%乙腈+0.1%甲磺酸溶液。

1.5 测试样品处理

分别称取0.1 g饲料添加剂样品和1 g预混料样品至100 mL容量瓶中,加入20 mL乙腈,40 ℃超声20 min,再加入20 mL超纯水,40 ℃超声20 min,恢复室温后用超纯水定容至刻度。取1.5 mL溶液转移至2 mL离心管中,15 000×g离心3 min,用0.1 μm有机相过滤膜过滤至样品瓶中,备用上机,每个样品做2个平行。

1.6 色谱条件

采用UPLC仪进行样品的色谱分析,该系统配备四元泵管理器以及可调节紫外(TUV)检测器,检测波长为210 nm,柱温为25 ℃,进样体积为1.6 μL。UPLC梯度洗脱程序见表1。
表1 UPLC梯度洗脱程序

Table 1 UPLC gradient elution program

时间
Time/min		 流速
Flow velocity/(mL/min)		 流动相A
Mobile phase A/%		 流动相B
Mobile phase B/%
0.00 0.20 90 10
5.00 0.20 90 10
5.17 0.20 0 100
7.00 0.20 0 100
7.17 0.20 90 10
8.33 0.20 90 10

1.7 样品特异性

根据《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》(GB/T 27417—2017)[8]对3-NOP含量的测定方法进行评价验证。将流动相A作为试剂空白,将SiO2和砻糠的混合物按照本试验测试样品处理方法处理后作为样品空白,以101.43 mg/L 3-NOP标准品为样品,采用UPLC法进行检测并记录各样品保留时间及峰面积。

1.8 线性和范围

称取约50 mg 3-NOP标准品到50 mL容量瓶中,一式两份(样品重量1=52.8 mg,样品重量2=57.3 mg),按照本试验3-NOP标准工作液的制备方法进行逐级稀释,得到2套不同浓度的标准工作液。记录各浓度点对应的峰面积,以基于实际称样量计算得出的配制浓度为x轴,峰面积为y轴,进行无加权线性回归(强制过原点)。通过回归方程反算各标准点的计算浓度,并计算计算浓度与配制浓度的偏差,以百分比表示。偏差计算公式如下:
偏差(%)=100×(3-NOP计算浓度-3-NOP配制浓度)/3-NOP配制浓度。

1.9 检出限(LOD)和定量限(LOQ)

向试剂空白样品溶液中加入已知浓度的3-NOP对照品,逐级稀释后,按照本试验色谱条件进行检测,记录3-NOP峰高与基线噪声的比值(信噪比,S/N)。当3-NOP的S/N为3左右时,即为LOD;当3-NOP的S/N为10左右时,即为LOQ。

1.10 提取效率

称取饲料添加剂和预混料各3批样品,每批做3个平行,按照本试验测试样品处理方法进行第1次3-NOP提取,然后使用真空抽滤装置抽滤处理好的样品,直至玻璃纤维过滤膜上无液体残留,再用5 mL乙酸乙酯清洗过滤膜2次,最后将玻璃纤维过滤膜及其上面残留的样品转移至50 mL容量瓶中,按照本试验测试样品处理方法进行第2次3-NOP提取,计算提取效率,公式如下:
提取效率(%)=100×第1次提取3-NOP含量/2次累计提取3-NOP含量。

1.11 精密度和回收率

饲料添加剂产品中主要成分为SiO2,预混料主要成分为砻糠,分别选取SiO2和砻糠作为空白基质;同时,配制3-NOP标准储备液,浓度为5 mg/mL。将不同体积的3-NOP标准储备液按照表2分别加入2种空白基质中,并用20%乙腈定容至100 mL,分别模拟饲料添加剂(3-NOP含量为10%)和预混料3(3-NOP含量为1.00%)中3-NOP含量的25%、50%、100%和150%,每个样品3个平行。
表2 空白基质3-NOP溶液配制

Table 2 Preparation of blank matrix 3-NOP solution

项目
Items		 空白基质质量
Blank matrix mass/mg		 3-NOP标准储备液体积
3-NOP standard reserve
liquid volume/mL		 3-NOP浓度
3-NOP concentration/
(μg/mL)



对照 Control		 0 0.5 25
0 1.0 50
0 2.0 100
0 3.0 150



二氧化硅 SiO2		 100 0.5 25
100 1.0 50
100 2.0 100
100 3.0 150



砻糠 Rice chaff		 1 000 0.5 25
1 000 1.0 50
1 000 2.0 100
1 000 3.0 150
通过将空白基质的3-NOP含量与对照的3-NOP含量进行比较来计算回收率,回收率(%)=100×空白基质3-NOP含量/对照3-NOP含量;将不同浓度下3个平行样3-NOP含量的相对标准偏差(RSD)用来评估精密度。精密度要求RSD<2%,回收率要求应在95%~105%[8]。

1.12 重复性

按照本试验方法测定3批饲料添加剂样品和3种预混料样品3-NOP含量,由同一个实验员在5个不同的工作日分别进行检测,计算日内、日间和总体RSD,并计算霍维茨比率(HorRat)。HorRat计算公式如下[9]:

HorRat=$\frac{\mathrm{R}\mathrm{S}{\mathrm{D}}_{\mathrm{t}\mathrm{o}\mathrm{t}\mathrm{a}\mathrm{l}}}{\mathrm{R}\mathrm{S}{\mathrm{D}}_{\mathrm{p}\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{d}\mathrm{i}\mathrm{c}\mathrm{t}\mathrm{e}\mathrm{d}}}$;

RSDtotal=CV;

RSDpredicted=2C-0.15。

式中:RSDtotal表示观察到的RSD(%);CV表示样品中3-NOP含量的变异系数(%);RSDpredicted表示预期RSD(%);C表示样品中3-NOP含量。

1.13 溶液稳定性

按照本试验方法制备2种3-NOP标准溶液(浓度分别为50.27和20.11 μg/mL)以及3批饲料添加剂和3种预混料样品,每个样品2个平行。标准品和样品制备好后,放置在样品盘中室温下储存,分别于0、10、20、54和90 h时测定3-NOP浓度或含量,并分析0与90 h之间的偏差以及每个处理所有分析的RSD。根据样品的测量值,以时间为横坐标,3-NOP浓度或含量为纵坐标建立回归方程y=ax+b,根据公式(a×90+b)×100/b计算标准溶液及样品中3-NOP在室温下储存90 h的稳定性。

2 结果与分析

2.1 样品特异性

如图1所示,红色色谱峰代表3-NOP浓度为101.43 μg/mL的标准溶液,黑色色谱峰代表试剂空白,绿色色谱峰代表样品空白;3-NOP的保留时间为1.624 min,试剂空白和样品空白中3-NOP保留时间相同处未出现干扰峰,表明该方法特异性良好、杂质干扰小。
图1 液相色谱图

3-NOP:3-硝基氧基丙醇

Fig.1 Liquid chromatogram

3-nitrooxypropanol。

2.2 线性和范围

以2套标准工作液各配制浓度的平均值及对应的峰面积平均值建立标准曲线,如图2所示,3-NOP标准溶液在1~200 μg/mL内的决定系数(R2)为0.999 6,表明3-NOP在浓度为1~200 μg/mL内线性关系良好;将每个浓度下峰面积数值分别代入标准曲线中得出3-NOP计算浓度,由表3可知,与配制浓度的平均偏差不超过5%,表明该线性关系良好[8]。
图2 3-NOP标准曲线

Fig.2 Standard curve of 3-NOP

表3 3-NOP标准品线性

Table 3 Standard linearity of 3-NOP

3-NOP配制浓度
3-NOP preparation
concentration/(μg/mL)		 峰面积
Peak area/
(μAU/s)		 3-NOP计算浓度
3-NOP calculation
concentration/(μg/mL)		 偏差
Deviation/%
200.51 2 369 746 199.89 -0.32
100.25 1 197 660 101.02 0.77
50.13 601 963 50.78 1.29
20.05 244 529 20.63 2.87
10.03 122 912 10.37 3.41
5.01 60 986 5.15 2.67
2.00 24 227 2.05 2.18
0.99 11 243 0.95 -4.32

2.3 LOD和LOQ

由表4可知,当样品中3-NOP浓度为0.04 μg/mL时S/N=3.05,因此LOD为0.04 μg/mL,即40 mg/kg;当样品中3-NOP浓度为0.15 μg/mL时S/N=11.43,因此LOQ为0.15 μg/mL,即150 mg/kg。
表4 3-NOP的LOD和LOQ

Table 4 LOD and LOQ of 3-NOP

项目 Items 检出限 LOD/(μg/mL) 信噪比 S/N 定量限 LOQ/(μg/mL) 信噪比 S/N
3-硝基氧基丙醇
3-NOP		 0.04 3.06 0.15 11.49
0.04 3.04 0.15 11.39
0.04 3.00 0.15 11.25
0.04 2.90 0.15 10.88
0.04 3.13 0.15 11.72
0.04 3.21 0.15 12.03
0.04 2.99 0.15 11.22
0.04 3.05 0.15 11.43
平均值 Mean 0.04 3.05 0.15 11.43

2.4 提取效率

由表5可知,3批饲料添加剂和3种预混料中3-NOP的提取效率均大于99%,表明第1次提取效果符合要求。
表5 3-NOP的提取效率

Table 5 Extraction efficiency of 3-NOP

项目
Items		 第1次提取3-NOP含量
3-NOP content in the
first extraction/
(mg/g)		 第2次提取3-NOP含量
3-NOP content in the
second extraction/
(mg/g)		 累计提取3-NOP含量
Accumulative extract
content of 3 -NOP/
(mg/g)		 提取效率
Extraction
efficiency/%
添加剂1 Additive 1 100.57 0.15 100.72 99.86
添加剂2 Additive 2 100.00 0.09 100.08 99.92
添加剂3 Additive 3 99.14 0.18 99.32 99.82
预混料1 Premix 1 5.41 0.01 5.42 99.79
预混料2 Premix 2 7.97 0.00 7.97 99.98
预混料3 Premix 3 10.50 0.01 10.51 99.89

2.5 精密度和回收率

由表6可知,3组样品在4个3-NOP含量梯度下RSD为0.06%~0.63%,均小于2%,表明精密度符合要求。在空白基质中,饲料添加剂的主要成分为SiO2,以SiO2为空白基质时,3-NOP回收率为99.74%~100.65%;预混料的主要成分为砻糠,以砻糠为空白基质时,回收率为100.16%~101.97%,测定结果符合《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》(GB/T 27417—2017)[8]要求。
表6 3-NOP检测的精密度和回收率

Table 6 Accuracy and recovery of 3-NOP detection%

3-NOP理论含量
3-NOP theoretical
content		 3-NOP在对照中含量
3-NOP content
in control		 3-NOP在SiO2中含量
3-NOP content in SiO2		 3-NOP在砻糠中含量
3-NOP content in
rice chaff		 3-NOP在空白基质中回收率
Recovery of 3-NOP in
blank matrix
测定值
Measured
value		 平均值
Mean		 相对标
准偏差
RSD		 测定值
Measured
value		 平均值
Mean		 相对标
准偏差
RSD		 测定值
Measured
value		 平均值
Mean		 相对标
准偏差
RSD		 二氧化硅
SiO2		 砻糠
Rice chaff
2.50 2.48

2.49

0.19		 2.50

2.49

0.14		 2.50

2.49

0.18

100.22

100.16
2.49 2.49 2.49
2.49 2.49 2.49
5.00 5.05

5.03

0.42		 5.01

5.02

0.21		 5.06

5.06

0.06

99.74

100.62
5.03 5.03 5.06
5.01 5.02 5.06
10.00 10.06

10.13

0.63		 10.10

10.10

0.15		 10.35

10.33

0.22

99.74

101.97
10.18 10.08 10.31
10.14 10.11 10.32
15.00 15.32

15.33

0.37		 15.38

15.42

0.24		 15.56

15.57

0.14

100.65

101.62
15.38 15.44 15.56
15.27 15.45 15.60

2.6 重复性

由表7可知,所有样品3-NOP检测的重复性均符合验收标准,总体RSD为1.10%~2.13%,其中日内RSD均小于2%,日间RSD均小于3%,HorRat≤0.03。根据AOAC重复性测定要求HorRat≤1.3[10-11],本方法测定样品3-NOP含量的精密度均满足要求。
表7 3-NOP检测的重复性

Table 7 Repeatability of 3-NOP detection

项目
Items		 3-NOP含量 3-NOP content/% 平均值
Mean/%		 相对标准偏差 RSD/% 霍维茨比率
HorRat
第1天
Day 1		 第2天
Day 2		 第3天
Day 3		 第4天
Day 4		 第5天
Day 5		 日内
Intra-day		 日间
Inter-day		 总体
Overall
添加剂1 Additive 1 10.09 10.11 10.20 10.32 10.06 10.16 1.47 1.49 1.48 0.02
添加剂2 Additive 2 10.09 10.23 10.49 10.14 10.00 10.19 1.50 2.61 2.13 0.03
添加剂3 Additive 3 10.04 10.19 10.13 10.16 9.91 10.09 0.17 1.57 1.10 0.01
预混料1 Premix 1 0.54 0.54 0.53 0.53 0.53 0.53 1.65 1.98 1.82 0.01
预混料2 Premix 2 0.80 0.79 0.78 0.79 0.79 0.79 0.94 1.44 1.21 0.01
预混料3 Premix 3 1.05 1.06 1.04 1.08 1.07 1.06 0.52 2.17 1.58 0.01

2.7 溶液稳定性

由表8可知,3-NOP标准品0与90 h间溶液浓度偏差小于3%,0~90 h溶液浓度RSD小于2%。由表9可知,3批饲料添加剂0与90 h间3-NOP含量偏差小于2%,0~90 h 3-NOP含量RSD小于0.2%;3种预混料0与90 h间3-NOP含量偏差小于1%,0~90 h 3-NOP含量RSD小于1%。由表10可知,90 h后,标准溶液中3-NOP浓度最多提高3.09%,饲料添加剂和预混料中3-NOP含量分别最多提高2.31%和0.57%,表明3-NOP的稳定性良好。
表8 3-NOP标准溶液在样品盘中的稳定性

Table 8 Stability of 3-NOP standard solution in sample tray

项目
Items		 3-NOP标准溶液浓度
3-NOP standard solution concentration/(μg/mL)
50.27 20.11
储存时间 Storage time/h
0 50.04 19.98
10 50.06 19.84
20 50.41 20.20
54 51.42 20.57
90 51.37 20.41
平均值 Mean 50.66 20.20
0与90 h间偏差 Deviation between 0 and 90 h/% 2.66 2.15
相对标准偏差 RSD/% 1.36 1.48
表9 饲料添加剂和预混料样品在UPLC样品盘中的稳定性

Table 9 Stability of feed additive and premix samples in UPLC sample tray

项目
Items		 3-NOP含量 3-NOP content/%
添加剂1
Additive 1		 添加剂2
Additive 2		 添加剂3
Additive 3		 预混料1
Premix 1		 预混料2
Premix 2		 预混料3
Premix 3
储存时间 Storage time/h
0 10.44 10.13 10.16 1.06 0.79 0.54
10 10.36 10.09 10.13 1.06 0.79 0.54
20 10.45 10.17 10.18 1.06 0.79 0.54
54 10.59 10.29 10.31 1.06 0.79 0.54
90 10.59 10.32 10.35 1.06 0.79 0.54
平均值 Mean 10.49 10.20 10.23 1.06 0.79 0.54
0与90 h间偏差
Deviation between 0 and 90 h/%		 1.44 1.88 1.87 0.26 0.74 -0.28
相对标准偏差 RSD/% 0.14 0.18 0.18 0.25 0.93 0.51
表10 标准品和样品中3-NOP的稳定性

Table 10 Stability of 3-NOP in standard products and samples

项目
Items		 回归方程
Regression equations		 3-NOP稳定性
3-NOP stability/%
标准溶液 Standard solution (50.27 μg/mL) y=0.017 2x+50.061 103.09
标准溶液 Standard solution (20.11 μg/mL) y=0.006 5x+19.975 102.93
添加剂1 Additive 1 y=0.002 4x+10.403 102.31
添加剂2 Additive 2 y=0.002 6x+10.111 102.25
添加剂3 Additive 3 y=0.002 5x+10.138 102.22
预混料1 Premix 1 y=0.000 01x+1.057 100.09
预混料2 Premix 2 y=0.000 05x+0.789 100.57
预混料3 Premix 3 y=0.000 003x+0.542 100.05

x表示时间(h),y表示3-NOP浓度(μg/mL)或含量(%)。

x represented time (h), and y represented concentration (μg/mL) or content (%) of 3-NOP.

3 讨论

欧盟委员会实施条例(EU)2022/565已授权3-NOP作为奶牛和繁殖用牛的饲料添加剂;经英国饲料添加剂专家评估,3-NOP在200 mg/kg DM剂量下对奶牛无组织病理学改变,无不良生产性能改变,确定3-NOP对目标物种的最大安全剂量为200 mg/kg DM,并建立了2倍安全裕度[12]。在我国,3-NOP尚未被批准作为饲料添加剂使用,同时3-NOP检测研究匮乏,研究精准定量方法对保障产品质量及减排效果至关重要。本研究建立的UPLC法在本实验室之前所用的高效液相色谱(HPLC)法[13]基础上进行针对性优化,以更细粒径色谱柱和更高系统压力,将每针样品检测时间从25 min缩短至8.33 min,提升了检测效率;同时,减少了流动相消耗,兼具经济性和环保性。本方法经验证表现优异,饲料添加剂和预混料中3-NOP提取效率超过99%,RSD为0.06%~0.63%(<2%),回收率为99.74%~101.97%,精密度和准确性满足痕量分析要求。综上所述,该UPLC法填补了相关研究空白,以“省时、省力、省费用”的优势及优异性能,为3-NOP相关产品质量控制提供了高效标准化方案,助力CH4减排产品在畜牧业中的规模化应用和质量规范管理。

4 结论

本研究建立了基于UPLC测定饲料添加剂和预混料中3-NOP的方法,该方法检测3-NOP的线性范围为1~200 μg/mL(R2=0.999 6),LOD和LOQ分别为40和150 mg/kg,RSD为0.06%~0.63%,回收率为99.74%~101.97%,可用于快速、高效和准确检测3-NOP含量。

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