油菜是我国主要油料作物之一,而菜籽粕(RSM)是油菜籽榨油后产生的副产品,是我国第二大蛋白质原料[1]。RSM不仅营养物质丰富[2-3],而且是维生素和矿物质的良好来源[4⇓-6],可作为蛋白质资源应用于水产饲料行业,用来填补蛋白质源饲料的短缺。然而,RSM含有硫甙、植酸和单宁等大量抗营养因子,这些物质不仅能降低RSM的营养价值,而且会对动物的生长性能及消化吸收功能产生不利影响,极大地限制了RSM在水产饲料中的应用[7⇓⇓⇓⇓-12]。因此,控制RSM的抗营养因子含量,提高蛋白质水平,可以减少RSM资源的浪费。
微生物发酵法具有成本低、发酵产物营养高、安全无污染等优点[13]。研究表明,微生物生长繁殖时分泌的生物活性酶会分解抗营养因子和蛋白质,使发酵菜籽粕(FRSM)中的抗营养因子含量明显降低,营养物质含量增加,适口性也明显改善[14-15]。目前,微生物发酵法成为改善RSM品质的重要研究方向。在以往研究中,尽管多种微生物被用于RSM发酵,但仍存在不足。因此,寻求符合《饲料添加剂品种目录》规定的微生物种类,对于FRSM在水产饲料业的开发和应用具有重大意义[16-17]。本试验通过RSM发酵前后品质的评估,旨在确定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的最适添加比例,优化RSM固态发酵条件,以期为提高RSM的饲用价值提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验菌种
枯草芽孢杆菌购自中国典型培养物保藏中心(微生物保藏编号:CCTCC AB 90008);酿酒酵母和植物乳杆菌由华中农业大学生命科学技术学院发酵与酶工程教研室赵述淼教授慷慨提供。
1.2 试验试剂
牛肉膏、氯化钯、钨酸钠-磷钼酸和植酸钠(上海麦克林生化科技有限公司);酚酞和单宁酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);植酸酶(10 000 U/g,武汉新华扬生物公司);纤维素酶(50 000 U/g,上海源叶生物科技有限公司);其他化学试剂均为分析纯,购自上海国药。
LB培养基(100 mL,枯草芽孢杆菌用):蛋白胨1 g,酵母粉0.5 g,氯化钠0.5 g,121 ℃灭菌20 min。
MRS培养基(100 mL,植物乳杆菌用):蛋白胨1 g,牛肉膏1 g,酵母粉0.5 g,葡萄糖2 g,无水醋酸钠0.5 g,柠檬酸二铵0.2 g,吐温-80 0.1 mL,硫酸镁0.058 g,硫酸锰0.025 g,121 ℃灭菌20 min。
YPD培养基(100 mL,酿酒酵母用):酵母粉1 g,蛋白胨2 g,葡萄糖2 g,121 ℃灭菌20 min。
固体培养基为上述液体培养基中加1.5~2.0 g的琼脂。
RSM固态发酵培养基:RSM经粉碎过60目筛,称取适量后置于250 mL锥形瓶中,121 ℃灭菌20 min,备用。
1.3 菌株制备
使用接种环将保藏在斜面上的单一菌种刮取2~3环,接种于对应培养基中,37 ℃振荡培养24 h,为一级种子液。再以一级种子液的5%接种于250 mL锥形瓶中,37 ℃振荡培养24 h,置于4 ℃冰箱备用。枯草芽孢杆菌菌液浓度为2.08×108 CFU/mL,酿酒酵母菌液浓度为1.25×107 CFU/mL,植物乳杆菌菌液浓度为1.36×108 CFU/mL。
1.4 固态发酵
将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和植物乳杆菌分别以1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2的比例接种于RSM固体发酵培养基,其中总接种量为12%,添加灭菌水至初始水分含量为60%,37 ℃发酵96 h,以相同处理不接菌种的RSM作为对照,每个处理3个重复。发酵完成后55 ℃烘干,粉碎过40目筛,-20 ℃保存备用。测定样品的硫甙、植酸、单宁、总酸含量及pH,以此选取最优的混菌比例。
按照上述方法,参照最优混菌比例将菌液接种于RSM固态发酵培养基,分别添加纤维素酶(0、0.50%、1.25%、2.00%)和植酸酶(0、0.03%、0.10%、0.33%)至发酵培养基,37 ℃发酵96 h。以相同处理不接菌种的RSM作为对照,每个处理3个重复。发酵完成后,55 ℃烘干粉碎过40目筛,-20 ℃保存备用。测定硫甙、植酸、单宁、粗蛋白质、总酸的含量及pH,以此选取最优的纤维素酶和植酸酶添加量。
参照优化的发酵条件对RSM进行固态发酵。其中,以相同处理不接菌种的RSM作为对照,每个处理3个重复。发酵完成后,55 ℃烘干粉碎过40目筛,-20 ℃保存备用。测定未发酵RSM和FRSM的硫甙、植酸、单宁、粗蛋白质、酸溶蛋白、总酸的含量及pH,以此评价FRSM的品质。
1.5 测定指标及方法
1.6 统计分析
采用SPSS 17.0软件对试验数据进行统计分析,所有数据结果均用平均值±标准误(n=3)表示,使用one-way ANOVA程序进行单因素方差分析,若差异显著,则采用Duncan氏多重比较法检验不同处理间的差异显著性,P<0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 混菌比例对固态FRSM的影响
由图1可知,与对照相比,混菌发酵可显著降低RSM的植酸含量(P<0.05),但不同混菌接种比例对植酸含量没有显著影响(P>0.05)。混菌比例为1∶1∶2时,总酸含量最高,且硫甙含量和pH最低。综合考虑,枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及植物乳杆菌的比例选取1∶1∶2时发酵效果较好,此时,RSM的抗营养因子得到有效降解,总酸含量得到显著提高。
2.2 纤维素酶添加对RSM混菌发酵效果的影响
由图2可知,与未添加纤维素酶相比,添加纤维素酶发酵的RSM的硫甙含量显著降低(P<0.05),总酸含量也显著增加(P<0.05)。随着纤维素酶添加量的增加,FRSM的植酸含量逐渐降低,粗蛋白质含量逐渐增加,纤维素酶添加量达到1.25%时,粗蛋白质含量趋于稳定。因此,综合考虑经济成本,在RSM发酵工艺中纤维素酶添加量为1.25%较合适。
2.3 植酸酶添加对RSM混菌发酵效果的影响
由图3可知,与未添加植酸酶相比,添加植酸酶发酵的FRSM的抗营养因子含量显著降低(P<0.05),总酸及粗蛋白质含量显著升高(P<0.05)。添加植酸酶发酵的FRSM的硫甙含量显著降低(P<0.05)。随着植酸酶添加量的增加,植酸及单宁含量逐渐降低,总酸及粗蛋白质含量逐渐增加,植酸酶添加量达到0.10%时趋于稳定。因此,RSM固态发酵选取0.10%的植酸酶添加量较合适。
2.4 FRSM的品质评价
RSM发酵前后的抗营养因子及营养成分含量如表1所示。固态发酵后,RSM中的硫甙、植酸和单宁含量分别降解了41.92%、40.10%和59.31%。与未发酵RSM相比,FRSM的粗蛋白质含量增加了16.59%,酸溶蛋白含量增加了41.85%,总酸含量增加了109.43%,pH由发酵前的6.53左右下降到5.68左右。上述结果说明,RSM可通过微生物发酵有效降低抗营养因子含量,增加粗蛋白质和总酸含量,从而改善适口性,提高RSM的营养价值。
表1 菜籽粕发酵前后抗营养因子及营养成分含量的变化Table 1 Changes of contents of anti-nutritional factors and nutritional composition in rapeseed meal before and after fermentation |
| 项目 Items | 菜籽粕 RSM | 发酵菜籽粕 FRSM | 变化率 Rate of change/% |
|---|---|---|---|
| 硫甙Glucosinolate/(μmol/g) | 56.91±0.42 | 33.05±0.40 | -41.92 |
| 植酸Phytic acid/(mg/g) | 74.27±0.32 | 44.49±0.50 | -40.10 |
| 单宁Tannin/(mg/g) | 23.43±0.77 | 9.53±0.39 | -59.31 |
| 粗蛋白质Crude protein/% | 36.81±0.29 | 42.99±0.04 | 16.59 |
| 酸溶蛋白Acid-soluble protein/% | 3.31±0.20 | 4.70±0.14 | 41.85 |
| 总酸Total acid/% | 1.59±0.08 | 3.33±0.05 | 109.43 |
| pH | 6.53±0.07 | 5.68±0.03 | -13.06 |
3 讨论
混菌发酵对抗营养因子的降解效果比单菌发酵好,主要原因可能是混菌产生的酶系比单菌更复杂,因此能够分解更多种的抗营养因子[14,22]。另外,不同的菌种接种比例对RSM的发酵存在差异[16,23]。在本研究中,FRSM的最佳接种比例为枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母∶植物乳杆菌=1∶1∶2。枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母均为《饲料添加剂品种目录》中允许添加的微生物。枯草芽孢杆菌生长繁殖时会产生蛋白酶、纤维素酶、植酸酶、维生素等多种物质,部分芽孢杆菌产生的酶可以裂解植物细胞壁,增加营养物质内外的流动性,从而增加蛋白质含量[24-25]。酵母菌本身含有丰富的蛋白质及维生素,其在生长繁殖时不仅能转化尿素和硫酸铵等物质,增加发酵培养基中的营养,而且产生的代谢物能刺激乳酸菌的生长繁殖[26]。
在饲料的实际生产中,微生物产生的酶可能酶量不足或活性低,这使RSM不能被完全分解。而酶解RSM并不能产生有用的微生物代谢物,如柠檬酸、草酸和乳酸[5]。菌酶协同发酵改善了单纯微生物发酵或酶解发酵的不足,它不仅能显著分解饲料中的大分子物质,而且能得到有机酸等微生物代谢产物,具有很高的实际生产价值。动物没有粗纤维降解相关酶,过量粗纤维不仅会增加动物饱腹感,降低摄食量,还会降低饲料转化率[28]。RSM含有大量的粗纤维,纤维素酶通过破坏植物细胞壁降解RSM中的粗纤维,可以增加RSM的利用率[29]。本研究结果表明,添加纤维素酶发酵的RSM的硫甙和植酸含量明显降低,粗蛋白质和总酸含量也得到增加。这与张妮娅等[30]的研究结果相似。植酸能和金属阳离子或蛋白质发生螯合作用,从而降低矿物质的生物效能,影响水解酶的活性,降低蛋白质的利用率并影响动物的消化吸收功能[6]。发酵RSM前添加外源植酸酶可以降解植酸,促进微生物生长繁殖时对RSM的分解利用,并提高有效磷含量[31]。在本研究中,添加植酸酶发酵的RSM的硫甙、植酸和单宁含量明显降低,粗蛋白质和总酸含量增加。朱秋华等[31]通过对酶解条件进行优化,发现植酸酶能够明显降低RSM中的植酸含量。
虽然RSM在我国资源丰富,但添加RSM至饲料中的水平过高会导致水产动物的生长性能和饲料系数降低,损伤鱼体的消化能力及抗氧化功能[32-33]。有研究表明,FRSM可以提高水产动物饲料中蛋白质的替代水平[34]。与未发酵RSM替代组相比,FRSM替代组可明显增加鱼类的生长性能及饲料利用率[29,35]。因此,研究FRSM有利于RSM在水产饲料行业的开发应用。在优化条件下,对RSM进行固态发酵,研究表明RSM中的抗营养因子(硫甙、单宁和植酸)含量均下降,粗蛋白质和总酸含量上升。这与姚晓红等[36]的研究结果类似,通过菌酶协同处理RSM,结果显示FRSM的硫甙、单宁和植酸含量分别降低了74.23%、31.17%和16.39%,粗蛋白质含量增加了1.92%。在发酵前提前使用酶分解RSM中微生物难以利用的大分子物质,可以促进微生物的生长繁殖,缩短发酵周期[17]。对其他植物性蛋白质源进行菌酶发酵,也得到了类似的结果,通过菌酶协同处理豆粕,表明发酵豆粕中的粗蛋白质、小肽及总酸含量都明显高于未发酵豆粕[35]。本研究表明,枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和植物乳杆菌联合纤维素酶和植酸酶对RSM进行固态发酵,能够显著提升RSM的品质,缩短发酵周期,有效解决RSM作为蛋白质原料受限的问题。
4 结论
发酵所用混菌比例为枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母∶植物乳杆菌=1∶1∶2、纤维素酶添加量为1.25%、植酸酶添加量为0.10%时,RSM发酵的效果较好。采用优化条件对RSM进行固态发酵,FRSM的硫甙、植酸和单宁含量分别降低了41.92%、40.10%和59.31%,粗蛋白质、酸溶蛋白和总酸含量分别增加了16.59%、41.85%和109.43%。RSM经纤维素酶和植酸酶水解,再采用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和植物乳杆菌进行固态发酵,降低了RSM中的硫甙、单宁和植酸含量,提高了粗蛋白质和总酸含量。因此,FRSM的营养价值改善,适口性增加,其品质大大提升,具有较高的饲用价值。但是,FRSM在水产饲料行业的应用仍需进一步研究。