Effects of Bacterial-Enzyme Synergism on Fermentation Quality of Three Silage Based on Orthogonal Test

WANG Ziyuan; JI Yuyu; SHU Jianhong; CHEN Ying; WANG Qian; WANG Xiaoli; YANG Chunyan

doi:10.12418/CJAN2024.459

Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 8: 5399 - 5410

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.459

RESEARCH PAPER

Effects of Bacterial-Enzyme Synergism on Fermentation Quality of Three Silage Based on Orthogonal Test

WANG Ziyuan ,
JI Yuyu ,
SHU Jianhong ,
CHEN Ying ,
WANG Qian ,
WANG Xiaoli ^,^* ,
YANG Chunyan

Expand

Guizhou Institute of Prataculture, Guiyang 550006, China

*professor, E-mail: wangxiaolizhenyuan@126.com

Received date: 2024-02-20

Online published: 2024-08-12

Fold

Abstract

This experiment was conducted to study the effects of different bacterial-enzyme combinations on the fermentation quality of three raw forage materials, and to screen the suitable combinations of bacterial-enzyme preparation and forage. A 4-factor 3-level orthogonal design was adopted, the 4 factors were cellulose decomposing bacteria (A), lactic acid bacteria (B), enzyme preparation (C) and raw material (D), each factor contained 3 levels. There were 9 groups in the experiment, with 3 replicates in each group. Group 1 was Bacillus subtilis+Enterococcus faecalis+cellulase+sweet sorghum, group 2 was Bacillus subtilis+Lactobacillus plantarum+xylanase+perennial forage maize, group 3 was Bacillus subtilis+Lactobacillus rhamnosus+amylase+napier grass, group 4 was Pantoea ananatis+Enterococcus faecalis+xylanase+napier grass, group 5 was Pantoea ananatis+Lactobacillus plantarum+amylase+sweet sorghum, group 6 was Pantoea ananatis+Lactobacillus rhamnosus+cellulase+perennial forage maize, group 7 was Herbaspirillum seropedicae+Enterococcus faecalis+amylase+perennial forage maize, group 8 was Herbaspirillum seropedicae+Lactobacillus plantarum+cellulase+napier grass, and group 9 was Herbaspirillum seropedicae+Lactobacillus rhamnosus+xylanase+sweet sorghum. Each group was evaluated for nutritional composition contents, fermentation parameters and microbial number after 60 days of ensiling. The results showed as follows: 1) the dry matter and soluble carbohydrate contents of groups 1, 5 and 9 were significantly higher than those of other groups (P<0.05), the crude protein content of group 5 was significantly higher than that of groups 2 and 6 (P<0.05), the neutral detergent fiber content of group 3 was significantly lower than that of groups 1 and 9 (P<0.05), and the acid detergent fiber content of groups 4 and 8 was significantly lower than that of other groups (P<0.05). 2) The pH and propionic acid content of group 4 were significantly lower than those of other groups (P<0.05), the lactic acid content of group 1 was significantly higher than those of other groups (P<0.05), the acetic acid content of groups 6, 7 and 8 was significantly higher than those of other groups (P<0.05), and the ammonia nitrogen content of group 1 was significantly lower than those of other groups (P<0.05). 3) The lactic acid bacteria number of groups 1, 2 and 5 was significantly higher than that of other groups (P<0.05), the mould number of group 9 was significantly lower than that of other groups (P<0.05), and the yeast number of group 5 was significantly lower than that of other groups except group 9 (P<0.05). The synthetic equilibrium method orthogonal analysis results showed that the order of factors influencing silage quality is raw material>enzyme preparation>lactic acid bacteria>cellulose decomposing bacteria. The optimal combination for orthogonal screening is Bacillus subtilis+Lactobacillus plantarum+xylanase+sweet sorghum.

Key words： cellulose decomposing bacteria; lactic acid bacteria; enzyme preparation; silage fermentation; orthogonal test

Cite this article

WANG Ziyuan , JI Yuyu , SHU Jianhong , CHEN Ying , WANG Qian , WANG Xiaoli , YANG Chunyan . Effects of Bacterial-Enzyme Synergism on Fermentation Quality of Three Silage Based on Orthogonal Test[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(8) : 5399 -5410 . DOI: 10.12418/CJAN2024.459

长期以来,在饲料中添加乳酸菌是调制优质青贮饲料的主要途径。已有研究表明,添加植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)等乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)能增加原料中有益微生物的数量,促进青贮饲料中乳酸(lactic acid,LA)发酵,从而改善发酵品质,提高饲料的消化率和营养价值^[1-2]。然而,随着畜牧业的迅猛发展,畜禽对饲草需求不断增加,导致了人们对饲草资源的需求和开发也越来越多。因此,单一添加乳酸菌已不能满足行业的发展,学者们开始将目光转向酶制剂。众多动物营养学家研究证实了酶制剂作为饲料添加剂在提高动物产品产量、免疫力以及繁殖性能方面的作用^[3⇓-5]。同时,研究表明将纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶等酶制剂与乳酸菌联合用于青贮饲料,能通过消化植物茎秆、谷粒和谷类的细胞壁中的纤维素和半纤维素,释放出单糖和淀粉以及细胞内的其他营养物质^[6],供乳酸菌进一步繁殖发酵所利用,从而提高饲草干物质和中性洗涤纤维的消化率,改善青贮饲料发酵过程,并提高其营养价值^[7]。

随着研究的深入,学者发现乳酸菌与酶制剂复合添加的效果受限于发酵底物,复合添加的比例和添加量也需要严格把控,以确保其发挥作用^[8]。然而,纤维素酶制备工艺复杂,投资成本相对较高,若将具有分泌纤维素酶功能的纤维素分解菌(cellulose decomposing bacteria,CDB)作为添加剂用于青贮饲料,是否能利用青贮初期的有氧环境进行繁殖活动,产生大量能降解植物细胞壁结构的酶类物质,为乳酸菌发酵提供更多底物,同时消耗氧气促进厌氧环境快速形成,以减少好氧性有害微生物活动,进而提高青贮饲料质量。国内外研究较多的纤维素分解菌多为白腐菌(Phellinus igniarius)、青霉菌(Penicillium funiculosumde)和里氏木霉(Trichoderma reesei)等真菌^[9-10],但真菌在降解纤维素过程中存在周期长、环境适应性差等问题。因此,筛选纤维素分解细菌已成为近年来的研究热点。

以往研究表明,在玉米秸秆中添加植物乳杆菌、肠膜状明串株葡聚糖菌亚种(Leuconostoc dextranicum subspecies)和具有分泌纤维素酶功能的啫麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)可降低青贮饲料中纤维素和半纤维素含量,提高LA和乙酸(acetic acid,AA)含量,青贮品质得到明显提升^[11]。目前,对于纤维素分解菌作为青贮添加菌剂与乳酸菌、酶制剂联合的研究鲜见报道,特别是有关适合于不同饲草原料的菌酶制剂组合研究更为少见。因此,本试验拟通过4因素3水平正交设计,探索不同菌酶制剂与青贮原料的协同效果,筛选最佳组合,为我国今后新型青贮菌剂的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将种植于贵州省草业研究所独山基地孕穗期的甜高粱、乳熟期的多年生饲草玉米以及平均株高达2.5 m的象草于2022年10月13日刈割,青贮前原料营养成分见表1。

表1 青贮前原料营养成分

Table 1 Nutritional composition of raw materials before silage

项目 Items	干物质 DM/% FW	粗蛋白质 CP/% DM	中性洗涤纤维 NDF/% DM	酸性洗涤纤维 ADF/% DM	可溶性碳水化合物 WSC/% DM
甜高粱Sweet sorghum	44.39	8.84	66.67	38.63	15.30
多年生饲草玉米Perennial forage maize	36.52	7.31	65.88	37.63	11.96
象草Napier grass	29.97	5.01	61.57	34.29	5.22

FW:鲜重 fresh weight。

试验菌株:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)购自上海鲁微科技有限公司;泛菌(Pantoea ananatis)和草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)由课题组前期分离于本地水稻秸秆,具有较高的羧甲基纤维素酶(carboxymethyl cellulase,CMCase)和木质素过氧化物酶(lignin peroxidase,Lip)活性,泛菌的CMCase和Lip活性分别为88.54、1.76 U/mL,草螺菌的CMCase和Lip活性分别为107.38、3.41 U/mL;植物乳杆菌分离于本地皇竹草青贮饲料,是一株产阿魏酸酯酶(ferulic acid esterases,FAE)乳酸菌。

纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶购自北京索莱宝科技有限公司,活性分别为3 000、50 000、3 700 U/g。

1.2 试验设计

试验采用L₉(3⁴)正交表进行设计,4因素分别是纤维素分解菌(A)、乳酸菌(B)、酶制剂(C)和原料(D)。每个因素设置3水平,A因素水平包括枯草芽孢杆菌(2.75×10⁷ CFU/g)、泛菌(1.67×10¹⁰ CFU/g)、草螺菌(6.5×10⁷ CFU/g);B因素水平包括粪肠球菌(8.75×10⁸ CFU/g)、植物乳杆菌(7×10⁸ CFU/g)、鼠李糖杆菌(3.9×10⁶ CFU/g);C因素水平包括纤维素酶(0.05%)、木聚糖酶(0.01%)、淀粉酶(0.03%);D因素水平包括甜高粱、多年生饲草玉米、象草。青贮前分别将纤维素分解菌和乳酸菌在LB和MRS液体培养基中培养48 h,平板计数后算出各菌液中的菌落总数,酶制剂按照说明书提供的溶解度配制成溶液,各添加剂均以鲜重为基础添加。试验共9个组,每组3个重复,正交试验设计见表2。

表2 正交试验设计

Table 2 Orthogonal experimental design

组别 Groups	因素Factors
	纤维素分解菌 Cellulose decomposing bacteria(A)		乳酸菌 Lactic acid bacteria(B)		酶制剂 Enzyme preparation(C)		原料 Raw materials(D)
	水平Levels		水平Levels		水平Levels		水平Levels
1	1	枯草芽孢杆菌	1	粪肠球菌	1	纤维素酶	1	甜高粱
2	1	枯草芽孢杆菌	2	植物乳杆菌	2	木聚糖酶	2	多年生饲草玉米
3	1	枯草芽孢杆菌	3	鼠李糖杆菌	3	淀粉酶	3	象草
4	2	泛菌	1	粪肠球菌	2	木聚糖酶	3	象草
5	2	泛菌	2	植物乳杆菌	3	淀粉酶	1	甜高粱
6	2	泛菌	3	鼠李糖杆菌	1	纤维素酶	2	多年生饲草玉米
7	3	草螺菌	1	粪肠球菌	3	淀粉酶	2	多年生饲草玉米
8	3	草螺菌	2	植物乳杆菌	1	纤维素酶	3	象草
9	3	草螺菌	3	鼠李糖杆菌	2	木聚糖酶	1	甜高粱

1.3 青贮饲料制备

将新鲜刈割的青贮原料均匀切短至2~3 cm,按照试验设计分别喷洒8 mL纤维素分解菌、8 mL乳酸菌和4 mL酶制剂在2 kg青贮原料上,充分混匀后每组称取3份600 g的样品装于真空袋内密封,置于室温(15±2) ℃避光保存60 d。

1.4 指标测定

称取20 g青贮样品,置于小型搅拌机,加入180 mL蒸馏水搅碎后用4层纱布和定性滤纸过滤,所得滤液用于测定发酵指标。pH采用德图Testo 206-pH1型测量仪测定,LA、AA和丙酸(propionic acid,PA)含量采用岛津LC-20A高效液相色谱测定,氨态氮(NH₃-N)含量采用苯酚-次氯酸钠法^[12]测定。

称取200 g青贮样品,105 ℃杀青15 min,而后65 ℃烘至恒重,将烘干样粉碎至40目用于测定营养指标。干物质(DM)含量采用烘箱干燥法(GB/T 6435—2014)测定,粗蛋白质(CP)含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—2018)测定,中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量采用Van Soest法^[13]测定,可溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法^[14]测定。

称取25 g青贮样品,加入225 mL蒸馏水,充分振摇30 min,制备10倍递增系列稀释样品匀液,采用平板计数法计算微生物数量。其中,乳酸菌采用MRS琼脂培养基36 ℃厌氧培养72 h,酵母菌和霉菌采用PDA琼脂培养基28 ℃培养72 h,记录稀释倍数和相应的活菌数,以lg(CFU/g FM)表示。

1.5 数据分析

使用Excel 2007对数据进行整理,运用SPSS 18.0进行正交设计的方差分析,多重比较采用Duncan氏法。采用极差法对各指标的4个因素进行主次顺序分析,极差值为该因素各水平平均值中最大值与最小值之差,极差值越大说明该因素对结果影响越大。ki为该因素i水平的平均值,ki越大说明该水平越优(NH₃-N、NDF、ADF、pH、PA、霉菌和酵母菌的ki越小说明该水平越优),最后运用综合平衡法分析筛选出最优组合。

2 结果与分析

2.1 不同处理对青贮饲料营养成分含量的影响

如表3所示,1组的DM含量最高,为32.69%;6组的DM含量最低,显著低于其他各组(P<0.05)。5组的CP含量最高,为7.11%;6组的CP含量最低,与5组相比显著降低了25.07%(P<0.05)。9组的NDF含量最高,为54.79%;3组的NDF含量最低,与9组相比显著降低了6.08%(P<0.05)。6组的ADF含量最高,为35.61%;8组的ADF含量最低,与6组相比显著降低了23.84%(P<0.05)。1组、5组和9组的WSC含量显著高于其他各组(P<0.05),其中9组的WSC含量最高,为14.56%;3组、4组和8组的WSC含量显著低于其他各组(P<0.05),其中8组的WSC含量最低,为4.63%。

表3 不同处理青贮饲料营养成分含量正交分析结果

Table 3 Orthogonal analysis results of nutritional composition contents of silage by different treatments %

项目 Items		因素/水平Factors/levels				干物质 DM	粗蛋白质 CP	中性洗涤纤维 NDF	酸性洗涤纤维 ADF	可溶性碳水化合物 WSC
项目 Items		A	B	C	D	干物质 DM	粗蛋白质 CP	中性洗涤纤维 NDF	酸性洗涤纤维 ADF	可溶性碳水化合物 WSC
组别 Groups	1	1	1	1	1	32.69±1.26^a	6.93±0.32^ab	54.57±0.48^a	32.68±1.67^ab	13.68±0.03^a
	2	1	2	2	2	23.76±0.48^c	5.68±0.23^bc	52.85±1.19^ab	35.34±1.98^ab	11.19±0.41^b
	3	1	3	3	3	26.59±0.38^b	5.79±0.43^abc	51.46±1.44^b	29.50±0.65^cd	4.86±0.52^c
	4	2	1	2	3	25.75±0.22^b	5.84±0.11^abc	52.20±1.43^ab	28.51±2.18^d	4.99±1.07^c
	5	2	2	3	1	32.61±0.37^a	7.11±0.30^a	53.99±0.64^ab	34.33±0.53^ab	14.04±0.78^a
	6	2	3	1	2	21.76±1.29^d	5.34±0.09^c	52.87±1.15^ab	35.61±0.57^a	11.10±0.53^b
	7	3	1	3	2	23.77±1.22^c	5.99±0.27^abc	53.11±0.32^ab	34.73±1.33^ab	10.36±0.35^b
	8	3	2	1	3	26.26±0.81^b	6.00±1.05^abc	52.04±1.63^ab	27.12±0.68^d	4.63±0.56^c
	9	3	3	2	1	31.77±0.55^a	6.78±1.02^ab	54.79±0.67^a	32.41±1.32^bc	14.56±0.63^a
干物质 DM	k1	27.68	27.40	26.90	32.36	最优组合:A₁B₂C₃D₁ 主次顺序:D>A>B>C
	k2	26.71	27.55	27.10	23.10
	k3	27.27	26.71	27.66	26.20
	R	0.98	0.84	0.76	9.26
粗蛋白质 CP	k1	6.14	6.25	6.09	6.94	最优组合:A₃B₂C₃D₁ 主次顺序:D>B>C>A
	k2	6.10	6.27	6.10	5.67
	k3	6.25	5.97	6.30	5.88
	R	0.15	0.29	0.21	1.27
中性洗涤纤维 NDF	k1	52.96	53.29	53.16	54.45	最优组合:A₁B₂C₃D₃ 主次顺序:D>C>A>B
	k2	53.02	52.96	53.28	52.94
	k3	53.31	53.04	52.85	51.90
	R	0.35	0.33	0.43	2.55
酸性洗涤纤维 ADF	k1	32.51	31.98	31.81	33.14	最优组合:A₃B₁C₁D₃ 主次顺序:D>A>C>B
	k2	32.81	32.26	32.09	35.23
	k3	31.42	32.51	32.86	28.38
	R	1.39	0.53	1.05	6.85
可溶性碳水化合物 WSC	k1	9.91	9.68	9.81	14.10	最优组合:A₂B₃C₂D₁ 主次顺序:D>B>C>A
	k2	10.05	9.96	10.25	10.89
	k3	9.85	10.17	9.76	4.83
	R	0.19	0.50	0.49	9.27

	ki为该因素i水平的平均值,R为极差。同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。
	ki was the average of i level of the factor. R was the range. In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

正交分析结果表明,各营养成分指标中的D因素极差均最大,说明原料因素对青贮饲料营养成分的影响最大。对于CP和WSC含量,B因素的极差均大于A、C因素,影响因素主次顺序为D>B>C>A;各因素水平CP含量的最优组合为A₃B₂C₃D₁,WSC含量的最优组合为A₂B₃C₂D₁。对于DM、NDF和ADF含量,A因素的极差大于B因素,其中DM含量的影响因素主次顺序为D>A>B>C,最优组合为A₁B₂C₃D₁;NDF含量的影响主次顺序为D>C>A>B,最优组合为A₁B₂C₃D₃;ADF含量的影响主次顺序为D>A>C>B,最优组合为A₃B₁C₁D₃。

2.2 不同处理对青贮饲料发酵参数的影响

如表4所示,4组的pH最低,显著低于其他各组(P<0.05);6组的pH最高,与4组相比显著提高了14.84%。1组的LA含量最高,为6.94%,显著高于其他各组(P<0.05);7组的LA含量最低,与1组相比显著降低了51.93%(P<0.05)。6组的AA含量最高,为5.34%,显著高于其他各组(P<0.05);5组的AA含量最低,与6组相比显著降低了55.80%(P<0.05)。4组的PA含量最低,为0.3%,3组、6组和7组的PA含量显著高于其他各组(P<0.05)。8组的NH₃-N含量最高,为29.91 mg/L,显著高于除6组外的其他各组(P<0.05);1组的NH₃-N含量最低,与8组相比显著降低了57.71%(P<0.05)。

表4 不同处理青贮饲料发酵参数正交分析结果

Table 4 Orthogonal analysis results of fermentation parameter of silage by different treatments

项目 Items		因素/水平Factors/levels				pH	乳酸 LA/%	乙酸 AA/%	丙酸 PA/%	氨态氮 NH₃-N/(mg/L)
项目 Items		A	B	C	D	pH	乳酸 LA/%	乙酸 AA/%	丙酸 PA/%	氨态氮 NH₃-N/(mg/L)
组别 Groups	1	1	1	1	1	3.93±0.19^de	6.94±0.05^a	3.54±0.17^c	0.45±0.07^e	12.65±0.89^e
	2	1	2	2	2	3.98±0.03^cd	5.84±0.13^b	2.80±0.06^d	1.11±0.15^c	26.23±2.98^c
	3	1	3	3	3	4.08±0.05^bcd	4.51±0.26^d	2.59±0.04^e	1.60±0.01^a	21.79±1.84^d
	4	2	1	2	3	3.73±0.01^e	5.81±0.06^b	2.91±0.08^d	0.32±0.04^e	19.69±2.22^cd
	5	2	2	3	1	4.09±0.19^bcd	5.49±0.01^c	2.36±0.17^f	0.78±0.14^d	18.97±0.19^cd
	6	2	3	1	2	4.38±0.03^a	3.57±0.01^e	5.34±0.05^a	1.79±0.15^a	28.74±0.76^ab
	7	3	1	3	2	4.24±0.22^ab	3.35±0.06^e	4.36±0.01^b	1.73±0.05^a	20.54±1.08^cd
	8	3	2	1	3	4.18±0.06^abc	5.58±0.02^bc	4.30±0.05^b	1.38±0.12^b	29.91±2.35^a
	9	3	3	2	1	4.07±0.02^bcd	5.79±0.25^b	2.78±0.03^d	0.67±0.04^d	17.27±1.20^d
pH	k1	4.00	3.97	4.17	4.03	最优组合:A₁B₁C₂D₃ 主次顺序:C>D=B>A
	k2	4.07	4.08	3.93	4.20
	k3	4.17	4.18	4.14	4.00
	R	0.17	0.21	0.24	0.21
乳酸LA	k1	5.77	5.37	5.37	6.08	最优组合:A₁B₂C₂D₁ 主次顺序:D>C>B>A
	k2	4.96	5.64	5.82	4.25
	k3	4.91	4.62	4.45	5.30
	R	0.86	1.02	1.36	1.82
乙酸AA	k1	2.98	3.60	4.39	2.89	最优组合:A₃B₁C₁D₂ 主次顺序:C>D>A>B
	k2	3.54	3.15	2.83	4.16
	k3	3.81	3.57	3.10	3.27
	R	0.84	0.45	1.56	1.27
丙酸PA	k1	1.06	0.84	1.21	0.63	最优组合:A₂B₁C₂D₁ 主次顺序:D>C>B>A
	k2	0.96	1.09	0.70	1.55
	k3	1.26	1.35	1.37	1.10
	R	0.30	0.51	0.67	0.92
氨态氮 NH₃-N	k1	20.23	20.64	20.75	16.29	最优组合:A₁B₃C₃D₁ 主次顺序:D>B>C>A
	k2	22.47	25.04	24.08	22.15
	k3	22.57	19.58	20.43	26.82
	R	2.35	5.46	3.65	10.52

正交分析结果表明,影响pH和AA含量的主要因素是C因素,其次是D因素,pH的最优组合为A₁B₁C₂D₃,AA含量的最优组合为A₃B₁C₁D₂。对于LA和PA含量,影响因素主次顺序为D>C>B>A,LA含量的最优组合为A₁B₂C₂D₁,PA含量的最优组合为A₂B₁C₂D₁。对于NH₃-N含量,影响因素主次顺序为D>B>C>A,最优组合为A₁B₃C₃D₁。

2.3 不同处理对青贮饲料微生物数量的影响

如表5所示,1组、2组和5组的乳酸菌数量显著高于其他各组(P<0.05),1组的乳酸菌数量最高,3组的乳酸菌数量最低。9组的霉菌数量显著低于其他各组(P<0.05),小于2.00 lg(CFU/g FM);8组的霉菌数量最高,与9组相比显著提高了33.11%(P<0.05)。3组的酵母菌数量最高,显著高于除1组、6组和8组外的其他各组(P<0.05);5组的酵母菌数量最低,与3组相比显著降低了17.80%(P<0.05)。

表5 不同处理青贮饲料微生物数量正交分析结果

Table 5 Orthogonal analysis results regarding microbial number of silage by different treatments lg(CFU/g FM)

项目 Items		因素/水平Factors/levels				乳酸菌 LAB	霉菌 Mould	酵母菌 Yeast
项目 Items		A	B	C	D	乳酸菌 LAB	霉菌 Mould	酵母菌 Yeast
组别 Groups	1	1	1	1	1	5.22±0.03^a	2.59±0.07^b	3.09±0.05^ab
	2	1	2	2	2	5.12±0.01^b	2.75±0.18^ab	2.93±0.08^bc
	3	1	3	3	3	4.93±0.01^d	2.86±0.06^ab	3.26±0.05^a
	4	2	1	2	3	4.96±0.01^d	2.74±0.16^ab	2.96±0.07^bc
	5	2	2	3	1	5.13±0.03^b	2.60±0.05^b	2.68±0.01^d
	6	2	3	1	2	4.97±0.03^d	2.76±0.13^ab	3.10±0.08^ab
	7	3	1	3	2	4.98±0.03^cd	2.57±0.14^b	2.90±0.13^bc
	8	3	2	1	3	4.95±0.06^d	2.96±0.11^a	3.10±0.13^ab
	9	3	3	2	1	5.05±0.04^c	1.98±0.16^c	2.85±0.08^cd
乳酸菌 LAB	k1	5.09	5.06	5.05	5.13	最优组合:A₁B₂C₁D₁ 主次顺序:D>A>B>C
	k2	5.02	5.07	5.04	5.02
	k3	4.99	4.98	5.01	4.95
	R	0.10	0.09	0.03	0.19
霉菌 Mould	k1	2.74	2.64	2.77	2.39	最优组合:A₃B₃C₂D₁ 主次顺序:D>C>B>A
	k2	2.70	2.77	2.49	2.70
	k3	2.50	2.53	2.68	2.85
	R	0.23	0.24	0.28	0.46
酵母菌 Yeast	k1	3.10	2.99	3.10	2.88	最优组合:A₂B₂C₂D₁ 主次顺序:D>C=A>B
	k2	2.92	2.90	2.92	2.98
	k3	2.95	3.07	2.95	3.11
	R	0.18	0.17	0.18	0.23

正交分析结果表明,各微生物数量指标中D因素的极差最大,说明影响微生物数量最主要的因素是D因素。对于乳酸菌数量,影响因素主次顺序为D>A>B>C,最优组合为A₁B₂C₁D₁。对于霉菌数量,影响因素主次顺序为D>C>B>A,最优组合为A₃B₃C₂D₁。对酵母菌数量,影响因素主次顺序为D>C=A>B,最优组合为A₂B₂C₂D₁。

2.4 不同处理青贮饲料正交试验综合平衡法分析

正交试验综合平衡法分析结果见表6,D因素在DM、CP、WSC、LA、PA、NH₃-N、乳酸菌、霉菌和酵母菌指标中的极差最大,说明D因素是影响青贮饲料营养成分和发酵品质的主要因素,除pH、NDF和ADF指标以D₃水平最优,AA指标以D₂水平最优外,其他指标都以D₁水平最优,说明在原料选择上以D₁水平最优。C因素在LA和AA指标中的极差最大,C₂水平在WSC、pH、LA、PA、霉菌和酵母菌指标均最优,即酶制剂选择上以C₂水平最佳。B因素在DM、CP、NDF、LA、乳酸菌和酵母菌指标都以B₂水平最优,说明乳酸菌选择上以B₂水平最佳。A因素在DM、NDF、pH、LA、NH₃-N和乳酸菌指标中均以A₁水平最优。因此,综合不同因素水平对青贮饲料品质的影响,由大到小顺序为D>C>B>A;最优组合是A₁B₂C₂D₁,其次为A₃B₁C₃D₃,最后是A₂B₃C₁D₂。

表6 正交试验综合平衡法分析结果

Table 6 Results of orthogonal analysis based on synthetic equilibrium method

项目 Items	因素Factors
	A		B		C		D
	水平Levels	R	水平Levels	R	水平Levels	R	水平Levels	R
干物质DM	1	0.98	2	0.84	3	0.76	1	9.26
粗蛋白质CP	3	0.15	2	0.29	3	0.21	1	1.27
中性洗涤纤维NDF	1	0.35	2	0.33	3	0.45	3	2.55
酸性洗涤纤维ADF	3	1.39	1	0.53	1	1.05	3	6.85
可溶性碳水化合物WSC	2	0.19	3	0.50	2	0.49	1	9.27
pH	1	0.17	1	0.21	2	0.24	3	0.21
乳酸LA	1	0.86	2	1.02	2	1.36	1	1.82
乙酸AA	3	0.84	1	0.45	1	1.56	2	1.27
丙酸PA	2	0.30	1	0.51	2	0.67	1	0.92
氨态氮NH₃-N	1	2.35	3	5.46	3	3.65	1	10.52
乳酸菌LAB	1	0.10	2	0.09	1	0.03	1	0.19
霉菌Mould	3	0.23	3	0.24	2	0.28	1	0.46
酵母菌Yeast	2	0.18	2	0.17	2	0.18	1	0.23

3 讨论

3.1 不同处理对青贮饲料营养成分的影响

在青贮过程中,适当的含糖量和乳酸菌数量是实现高品质青贮发酵的重要因素。本试验所用的甜高粱和多年生饲草玉米的WSC含量,满足良好发酵青贮的理论要求,能够为乳酸菌发酵提供充足的底物,促进青贮体系中LA的大量生成,确保了青贮发酵品质。DM和CP含量是评价饲料中营养成分的重要指标,与未青贮的饲草原料相比,青贮后各组的DM和CP含量均下降,可能是青贮发酵过程中饲草中的植物蛋白酶和微生物共同作用将真蛋白分解为氨、肽等物质,从而导致了DM和CP的损失。其中,1组、5组和9组的DM、CP和WSC含量均高于其他各组,这是由青贮原料的营养特性所决定的,因此从极差分析来看,甜高粱是影响营养成分的最佳水平。饲草中NDF和ADF含量直接影响着牧草品质,与饲料的采食量和消化率呈负相关^[15]。本试验中,影响粗纤维含量的主要因素是原料,其中以象草最优。有研究表明,直接对象草进行青贮的效果较差^[16],这可能是因为象草茎杆中空、粗硬,青贮过程中难以通过压实排尽空气,加之WSC含量低,乳酸菌底物不足,影响了青贮发酵效果^[17]。试验中的象草因添加了菌酶制剂,在增加乳酸菌数量的同时,还为乳酸菌活动提供了发酵底物,保证了青贮的发酵品质。同时,酶制剂和纤维素分解菌的联用还促进了植物细胞壁中纤维组分的水解,从而降低青贮原料中粗纤维含量,与另外2种青贮原料相比,象草半纤维素含量(23.52%)较高,可能原因是原料组织结构的特异性导致其降解的差异,相较于木质化程度较高的甜高粱和多年生饲草玉米,象草茎叶较多的非木质化薄壁细胞更容易降解^[18]。此外,从极差分析中可以看出,乳酸菌剂和酶制剂2个因素中,植物乳杆菌水平和淀粉酶水平的组合是影响DM、CP和NDF指标的最优组合。前人研究表明,经淀粉酶处理的青贮饲料DM损失较对照组少^[19],这可能是由于淀粉酶能随机作用于淀粉、糖原、寡糖或多聚糖分子内部的1,4-糖苷键,将其水解成一系列小分子物质,供乳酸菌快速繁殖利用,使青贮体系尽快达到稳定期,保护了青贮饲料中更多的原始氮和其他组成成分免受好氧微生物的降解^[20],势必会提高青贮饲料的营养价值。

3.2 不同处理对青贮饲料发酵指标的影响

pH和有机酸含量能直接反映青贮发酵品质的优劣,pH和PA含量低、LA含量高,说明青贮饲料品质优良,反之则说明青贮质量不佳。NH₃-N含量是反映青贮饲料中蛋白质降解程度的指标,其含量越高,表明蛋白质分解越多^[21];适宜的AA含量有助于提高青贮饲料的有氧稳定性,抑制有氧暴露后好氧微生物的生长。本试验中,除6组、7组的pH大于4.2以外,其余各组的pH均小于4.2,其中添加泛菌、粪肠球菌和木聚糖酶的4组获得最低pH和PA含量。同时,添加粪肠球菌的1组LA含量最高,PA和NH₃-N含量相对较低,这可能是由于粪肠球菌属于肠球菌属,是用于生产LA的主要菌属^[22];研究发现,青贮发酵体系中乳杆菌属和肠球菌属是促进LA发酵的主要菌群^[23],能增加青贮初期乳酸菌的数量,迅速降低青贮原料的pH,从而提高青贮感官品质。此外,课题组前期在水稻秸秆中筛选出的泛菌具有高纤维素降解活性,有研究认为泛菌会与乳酸菌竞争发酵底物,是不期望的微生物^[24]。然而,一些研究认为泛菌有益于青贮发酵,因为它降低了青贮饲料的NH₃-N含量和pH^[25],这与本试验结果相似。泛菌是一种革兰氏阴性细菌,可以作为一种植物拮抗细菌,有助于植物对抗病原体的侵袭,同时具有潜在益生功能,如促进宿主植物生长和提高作物产量等^[26-27]。然而泛菌在青贮饲料中的应用报道较少,对其在青贮发酵中的作用有待进一步深入研究。

通过正交分析发现,添加木聚糖酶的处理能获得较高的LA含量,以及较低的PA含量和pH。分析原因可能是因为酶促过程中,由微生物分泌的纤维素酶首先水解植物纤维素释放出游离糖后,使得纤维素与半纤维素结构变得疏松^[28],而木聚糖酶属于半纤维素的主要水解酶类,暴露后的半纤维素迅速被木聚糖酶分解为可溶性多糖和单糖,继而被乳酸菌生长繁殖所利用,最终增加LA生成^[29]。

3.3 不同处理对青贮饲料微生物数量的影响

青贮发酵是一个完全基于微生物的发酵过程,因此微生物数量的评估对于提高我们对微生物在青贮过程中的作用的认识和理解是十分必要的。Kim等^[30]研究表明,较高的酵母菌数量可能会降低开窖阶段的有氧稳定性,并降低青贮饲料的营养价值。本试验中,1组的乳酸菌数量最高,这也印证了该组具有最高的LA含量。从极差分析来看,添加植物乳杆菌的青贮饲料中乳酸菌数量相对较高,同时酵母菌数量明显减少,这意味着青贮饲料有氧稳定性将被提高。植物乳杆菌是课题组定向筛选得的一株产阿魏酸酯酶乳酸菌,在细胞壁中阿魏酸及其二聚体与半纤维素、木质素通过酯键相连,形成致密的网状结构^[31],使纤维素酶难以发挥作用。而阿魏酸酯酶可以破坏植物细胞壁中木质素和多糖之间的链接,促进纤维素酶对细胞壁组分的进一步降解^[32]。前人研究发现,牧草青贮时接种产阿魏酸酯酶乳酸菌能有效地减少酵母菌数量,这与本研究结果一致,可能是因为青贮过程中通过降解木质纤维素释放出的游离阿魏酸,能够提高青贮饲料的抗氧化酶活性^[33-34],同时促进细菌内部的氧化应激反应,最终导致其死亡。

此外,本研究还发现,接种鼠李糖杆菌能显著降低青贮饲料中霉菌数量,这可能与鼠李糖杆菌代谢产物具有抑菌功能有关。Xia等^[35]研究发现,在高水分多花黑麦草中接种鼠李糖杆菌能增加二肽含量;二肽的产生在提高发酵质量方面起着重要作用^[36];同时鼠李糖杆菌显著上调了黄酮和黄酮醇生物合成途径中的类黄酮化合物含量,作为一类主要的植物次生代谢物,黄酮类化合物具有抗氧化、抗糖尿病、抗微生物、抗突变和抗癌等低毒作用,对动物健康和福利具有良好的影响^[37]。这一发现可能说明,鼠李糖乳杆菌在限制微生物的酶活性、抑制细菌消耗的肽和必需氨基酸方面具有一定效果。

4 结论

本试验通过综合平衡法正交分析表明,影响青贮饲料营养价值和发酵品质的因素顺序为:原料>酶制剂>乳酸菌>纤维素分解菌,4因素各水平的最佳组合是A₁B₂C₂D₁,即枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌+木聚糖酶+甜高粱;其次是A₃B₁C₃D₃,即草螺菌+粪肠球菌+淀粉酶+象草;最后是A₂B₃C₁D₂,即泛菌+鼠李糖杆菌+纤维素酶+多年生饲草玉米。

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