Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 4: 2716 - 2727

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.227

RESEARCH PAPER

Optimization of New Ultrasound-Assisted Extraction Process for Mulberry Leaf Protein and Investigation of Its Antioxidant Activity

  • ZHOU Yichen ,
  • WEI Xubiao ,
  • LI Zhenzhen ,
  • ZHANG Haosen ,
  • ZHANG Rijun , *
Expand
  • State Key Laboratory of Animal Nutrition, Laboratory of Feed Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
* professor, E-mail:

Received date: 2023-08-07

  Online published: 2025-04-15

Fold

Abstract

This study was conducted to optimize the extraction process of mulberry leaf protein and explore its antioxidant activity in vitro. On the basis of the extraction of mulberry leaf protein by ultrasonic crushing assisted alkali-solution and acid-isolation method, a single factor test was carried out first, and then combined with the results of single factor test, the Box-Behnken response surface method was used to further optimize the solid-liquid ratio, leaching temperature, ultrasonic time and ultrasonic power, so as to determine the best extraction conditions. Then the biological activity of mulberry leaf protein extracted by the new process was determined by chemical antioxidant capacity assay. The results showed as follows: 1) the optimized extraction process of mulberry leaf protein was as follows: solid-liquid ratio of 1∶24 (g/mL), leaching temperature 30 ℃, ultrasonic time 4.9 min, ultrasonic power 235 W, pH 11 in leaching solution, leaching time 60 min. Under these conditions, the extraction rate of mulberry leaf protein was 34.12%. 2) At the concentration of 0.4 mg/mL, the scavenging rates of 2,2-biazo-bis (3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) radical, 1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine (DPPH) radical and hydroxyl radical reached 100.47%, 74.92% and 34.94%, respectively, and the reducing power reached 0.43. In conclusion, this study optimized the extraction process of mulberry leaf protein through single factor test and response surface test, and the extracted mulberry leaf protein showed better antioxidant activity under this process.

Key words： mulberry leaf protein; alkali-solution and acid-isolation method; ultrasonic crushing; process optimization; antioxidant ability

Cite this article

ZHOU Yichen , WEI Xubiao , LI Zhenzhen , ZHANG Haosen , ZHANG Rijun . Optimization of New Ultrasound-Assisted Extraction Process for Mulberry Leaf Protein and Investigation of Its Antioxidant Activity[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(4) : 2716 -2727 . DOI: 10.12418/CJAN2025.227

桑叶是桑(Morus alba L.)的主要产品,过去主要用作桑蚕饲料和中药原料[1]。我国是全球最大的桑树种植国家,拥有丰富的桑叶资源[2]。然而,由于利用途径有限,桑叶资源存在巨大的浪费。因此,近年来,桑叶资源的开发利用成为研究的热点。桑叶中含有丰富的活性物质,如黄酮、生物碱、多酚和多糖。研究表明,这些小分子活性物质具有降血糖[3]以及增强免疫[4]和肠道屏障功能[5]的作用。不过,桑叶中高达24.7%粗蛋白质含量(干物质基础)却常常被忽视,并且目前的研究主要集中在其营养价值方面,对活性方面的研究较为有限。有研究表明,植物蛋白质经过提取纯化后也展示出良好的生物活性[6⇓-8]。因此,对桑叶蛋白(mulberry leave protein,MLP)的提取和生物活性的研究不仅对于桑叶资源的深度开发利用具有实际意义,而且具有重要的学术价值。
碱溶酸沉法是一种利用蛋白质在碱液中溶解度较高,在酸性环境中发生等电点沉淀的原理提取蛋白质的方法。该方法具有工艺简单、提取条件温和、蛋白提取率高和生产成本低等优点,适合实现工业化生产与应用[9]。超声破碎法是利用超声波在液体中的分散效应,产生空化作用,从而实现液体中固体颗粒或细胞组织的破碎[10]。目前并未有超声破碎辅助碱提法提取桑叶蛋白工艺优化的研究。因此,本研究旨在构建超声破碎辅助碱溶酸沉法提取蛋白的新工艺和方法,并通过单因素试验、响应面和Box-Behnken试验设计等方法对提取工艺进行进一步优化,以确定最佳的提取条件;并进一步通过化学抗氧化能力试验测定新工艺提取的桑叶蛋白的生物活性,以确定最优提取工艺,进而为桑叶资源的开发利用提供新的途径和技术与理论指导。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

桑叶(粤桑69851)购自广西隆安县桑海田园果蔬种植家庭农场桑基地,收割于6月;3.5 ku透析袋购自美国杰乐普公司。
牛血清蛋白标准液、考马斯亮蓝G-250、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、抗坏血酸和水杨酸购自北京索莱宝科技有限公司;氢氧化钠、碳酸钠、过氧化氢、无水乙醇(优级纯,GR)、三氯乙酸、硫酸亚铁、氯化铁、铁氰化钾和盐酸购自国药集团化学试剂有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。以上试剂如无特别标注,皆为分析纯(AR)级。

1.2 主要仪器与设备

全波长酶标仪SpectraMax M5E(Molecular Devices,美国),分析天平AL204-IC、pH计LE409(Mettler,瑞士),电热恒温水浴锅DK-8A(上海精宏实验设备限公司),高速冷冻离心机5424R(Eppendorf,德国),细胞超声粉碎仪JY92-IIN(宁波新艺超声设备有限公司),冷冻干燥机LGJ-10C(北京四环科学仪器厂有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 桑叶粉的制备

将新鲜桑叶洗净后过夜阴干,于烘箱55 ℃烘至恒重,通风冷却后放入破碎机破碎,过60目筛后得桑叶粉,于-20 ℃存放。桑叶粉粗蛋白质含量实测为16.64%。

1.3.2 桑叶蛋白的提取

参照Chen等[11]的方法,并略作修改。称取一定质量的桑叶粉,加入适量去离子水,再用0.5 mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液和0.5 mol/L的盐酸(HCl)溶液调节pH,使之最终达到一定料液比,涡旋混匀,超声破碎后放入水浴锅浸提,浸提结束后以6 000×g离心10 min,取上清,即为桑叶蛋白提取液;用稀盐酸调节桑叶蛋白浸提液至pH 4.0,静置20 min后以8 000×g离心10 min,弃去上清,用去离子水清洗沉淀,重复2次,再用去离子水重新溶解并调节至中性,用截留量为3.5 ku的透析袋在去离子水中透析48 h除盐,期间定期更换透析液,透析完毕经冷冻干燥得到桑叶蛋白粉,于-20 ℃存放。

1.3.3 桑叶蛋白含量的测定

桑叶粉和桑叶蛋白粉的总蛋白质含量参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法。蛋白浸提液的蛋白质含量采用Bradford法测定,方法简述为:用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液将牛血清蛋白(BSA)标准液稀释成不同的浓度梯度,与稀释适宜倍数的蛋白浸提液加入96孔板,每孔添加20 μL,再加入1×G250染料200 μL,室温静置3 min后测定600 nm吸光度(OD)值(OD600),参照BSA标准曲线即可计算得蛋白浸提液的蛋白质含量。按下列公式计算桑叶蛋白的提取率:
桑叶蛋白提取率(%)=100×(桑叶蛋白浸提液的蛋白质含量×桑叶蛋白浸提液体积×稀释倍数)/(桑叶粉的质量×桑叶粉总蛋白质含量)。

1.3.4 桑叶蛋白提取工艺的单因素试验

参照上述桑叶蛋白的提取流程,基础提取条件设为料液比1∶20(g/mL,下同)、浸提液pH 9、浸提温度40 ℃、超声功率260 W、超声时间5 min、浸提时间40 min;以桑叶蛋白提取率为指标,保持其他条件不变的情况下分别考察不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、浸提液pH(8、9、10、11、12)、浸提温度(20、30、40、50、60 ℃)、浸提时间(20、40、60、80、100 min)、超声功率(130、195、260、325、390 W)、超声时间(3、4、5、6、7 min)对其的影响;每个处理重复3次。

1.3.5 桑叶蛋白提取工艺的响应面优化

根据单因素优化试验的结果,选取影响显著的4个因素:料液比(A)、浸提温度(B)、超声时间(C)和超声功率(D),以桑叶蛋白提取率为响应值,使用Design Expert 10.0软件进一步进行Box-Behnken设计和响应面优化,试验因素及水平见表1。
表1 响应面分析试验因素及水平

Table 1 Factors and levels of response surface methodology

水平
Levels		 因素Factors
料液比
Solid-liquid ratio
(A)/(g/mL)		 浸提温度
Leaching temperature
(B)/℃		 超声时间
Ultrasound time
(C)/min		 超声功率
Ultrasonic power
(D)/W
-1 1∶15 20 4 195
0 1∶20 30 5 260
1 1∶25 40 6 325

1.3.6 桑叶蛋白的抗氧化活性研究

1.3.6.1 ABTS自由基清除率的测定

称取适宜质量的桑叶蛋白溶于去离子水并稀释成0.05~0.40 mg/mL(以Bradford法测定蛋白质含量计)。将7 mmol/L的ABTS和2.4 mmol/L的过硫酸钾等体积混合,室温避光反应16 h,得到ABTS自由基溶液。再用PBS(pH 7.4)将ABTS自由基溶液稀释至734 nm处OD值(OD734)=0.70±0.02,得到ABTS工作液,然后将300 μL的样品加到2 mL的ABTS工作液中,室温下避光反应10 min,测得OD734=A1。空白组和对照组分别以等体积去离子水代替ABTS工作液和样品,分别测得OD734=A0和A,以抗坏血酸作为阳性对照。按下列公式计算ABTS自由基清除率:
ABTS自由基清除率(%)=100×[1-(A1-A0)/A]。

1.3.6.2 DPPH自由基清除率的测定

称取适宜质量的桑叶蛋白溶于去离子水并稀释成0.05~0.40 mg/mL(以Bradford法测定蛋白质含量计)。使用无水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH工作液,将1 mL的样品加入2 mL的DPPH工作液,充分振荡混匀后,室温下避光反应30 min,测得517 nm处OD值(OD517)=A1,空白组以等体积乙醇代替DPPH溶液,测得OD517=A0,对照组以等体积去离子水替代样品,测得OD517=A,以抗坏血酸作为阳性对照。按下列公式计算ABTS自由基清除率:
DPPH自由基清除率(%)=100×[1-(A1-A0)/A]。

1.3.6.3 羟基自由基清除率的测定

称取适宜质量的桑叶蛋白溶于去离子水并稀释成0.05~0.40 mg/mL(以Bradford法测定蛋白质含量计)。将1.5 mL水杨酸(1.8 mmol/L)、2 mL硫酸亚铁(1.8 mmol/L)、1 mL过氧化氢(6 mmol/L)先后加入1 mL的样品,充分振荡混匀后,37 ℃反应30 min,再以3 000 r/min离心5 min,取上清测得样品的510 nm处OD值(OD510)=A1;空白组和对照组分别以等体积去离子水代替水杨酸和样品,分别测得OD510=A0和A,以抗坏血酸作为阳性对照。按下列公式计算羟基自由基清除率:
羟基自由基清除率(%)=100×[1-(A1-A0)/A]。

1.3.6.4 还原力的测定

称取适宜质量的桑叶蛋白溶于去离子水并稀释成0.05~0.40 mg/mL(以Bradford法测定蛋白质含量计)。取1 mL样品加入2.5 mL的碳酸钠缓冲溶液(0.2 mol/L、pH 6.6)和2.5 mL 1%(质量体积分数)的铁氰化钾,充分振荡混匀后于50 ℃反应20 min;再加入2.5 mL的三氯乙酸(10%,质量体积分数)并以3 000 r/min离心10 min;取2.5 mL的上清液加入等体积的去离子水和0.5 mL的三氯化铁(0.1%,质量体积分数)混合均匀室温放置10 min,测得OD600,以抗坏血酸作为阳性对照。样品还原力与OD600成正比。

1.4 数据处理与分析

每组试验独立重复3次,结果以“平均值±标准差”的形式表示。采用Excel 2019和SPSS 27.0进行数据处理与分析,并采用Origin 2019进行绘图。采用一般线性模型对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并通过Tukey’s多重比较检验各组数据的差异显著性,其中P<0.05设为差异显著,P<0.01设为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 桑叶蛋白提取单因素试验

2.1.1 浸提温度对桑叶蛋白提取率的影响

浸提温度对桑叶蛋白提取率的影响如图1所示。在浸提温度为20~30 ℃时,桑叶蛋白提取率与浸提温度呈正相关,在30 ℃达到最大值(20.30±2.01)%,这是因为提高浸提液温度可以促进分子间的运动,进而使桑叶蛋白更容易溶出,说明适当升高浸提温度能够促进桑叶蛋白溶出,提高桑叶蛋白提取率。在浸提温度为30~60 ℃时,随着浸提温度的升高,桑叶蛋白的提取率显著下降(P<0.05),说明桑叶蛋白的热稳定性较差,容易因环境温度的升高而变性沉淀,这一现象在50~60 ℃表现得尤为明显,桑叶蛋白提取率从(14.85±0.26)%骤降到(5.06±0.29)%。因此,适宜的提高浸提温度有助于提高桑叶蛋白的提取率,选取30 ℃为桑叶蛋白提取最佳浸提温度。
图1 浸提温度对桑叶蛋白提取率的影响

数据点标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2至图6同。

Fig.1 Effects of leaching temperature on extraction rate of MLP

Data point labeled with the same lowercase letters indicated a non-significant difference (P>0.05), and with different lowercase letters indicated a significant difference (P<0.05). The same as Fig.2 to Fig.6.

2.1.2 浸提液pH对桑叶蛋白提取率的影响

浸提液pH对桑叶蛋白提取率的影响如图2所示。在pH为8~12时,桑叶蛋白提取率随着浸提液pH的提高而提高,这是因为在碱性条件下,蛋白质结构发生变化,蛋白质分子次级键(氢键)发生破坏,某些极性基团发生解离,促进蛋白质与结合物分离,从而更容易溶解到浸提液中[9]。但过高的碱液浓度会使蛋白质发生美拉德反应,营养学特性发生变化[12],对于蛋白质生物活性是否有影响还有待进一步考察。除此以外,碱溶过程中使用大量的碱也会造成生产成本升高以及环保等问题。故综合考虑,选取pH 11为桑叶蛋白提取最佳浸提液pH。
图2 浸提液pH对桑叶蛋白提取率的影响

Fig.2 Effects of pH in leaching solution on extraction rate of MLP

2.1.3 浸提时间对桑叶蛋白提取率的影响

浸提时间对桑叶蛋白提取率的影响如图3所示。浸提时间从20 min提高到60 min,桑叶蛋白提取率显著提高(P<0.05),并在60 min时达到最高值(29.51±0.52)%,之后便趋于平缓。这说明桑叶蛋白的溶出是一个需要一定时间的过程,适当提高浸提时间有助于桑叶蛋白的充分溶出,但是过长的浸提时间对提高桑叶蛋白提取率作用不大,只会增加时间成本,故选取60 min为桑叶蛋白提取最佳浸提时间。
图3 浸提时间对桑叶蛋白提取率的影响

Fig.3 Effects of leaching time on extraction rate of MLP

2.1.4 料液比对桑叶蛋白提取率的影响

料液比对桑叶蛋白提取率的影响如图4所示。料液比从1∶10提高到1∶20,桑叶蛋白提取率显著增高(P<0.05),过低的料液比会使浸提液中的桑叶蛋白浓度过早地达到饱和,从而不利于桑叶蛋白的充分溶解,料液比为1∶20时,桑叶蛋白提取率达到最大值(26.40±0.51)%,之后便趋于平缓。这是由于提高料液比可以增加桑叶蛋白与浸提液的接触面积,说明适当提高料液比有助于桑叶蛋白的提取,但是过高的料液比对桑叶蛋白提取作用不大,并且会增加后续酸沉试剂的用量,增加生产成本。故选取1∶20为桑叶蛋白提取最佳料液比。
图4 料液比对桑叶蛋白提取率的影响

Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of MLP

2.1.5 超声时间对桑叶蛋白提取率的影响

超声时间对桑叶蛋白提取率的影响如图5所示。超声时间从3 min提高到5 min,桑叶蛋白提取率显著提高(P<0.05),这是因为超声破碎能够有效地破坏植物细胞的细胞壁结构,使桑叶细胞内的蛋白质溶出,以及超声产生的热效应会增加分子间的运动[10],从而增加桑叶蛋白提取率。但是当超声时间从5 min提高到7 min,桑叶蛋白提取率与超声时间呈负相关,这是由于超声运动产生过多的热效应使桑叶蛋白受热变性沉淀。故选取5 min为桑叶蛋白提取的最佳超声时间。
图5 超声时间对桑叶蛋白提取率的影响

Fig.5 Effects of ultrasound time on extraction rate of MLP

2.1.6 超声功率对桑叶蛋白提取率的影响

超声功率对桑叶蛋白提取率的影响如图6所示。超声功率从130 W提高到260 W,桑叶蛋白提取率显著提高(P<0.05),这是因为超声功率的提高能够加强超声对植物细胞的细胞壁的破坏作用,同时也能产生更多的热效应,增加分子间运动,提高桑叶蛋白提取率。与超声时间相同,过高的超声功率也会因为产生过多的热效应而使桑叶蛋白受热变性沉淀,造成桑叶蛋白的损失,这在超声功率从260 W提高到390 W的过程中有所体现。故选取260 W为桑叶蛋白提取的最佳超声功率。
图6 超声功率对桑叶蛋白提取率的影响

Fig.6 Effects of ultrasonic power on extraction rate of MLP

2.2 桑叶蛋白提取率的响应面优化

2.2.1 试验结果与方差分析

以单因素试验结果为基础,确定响应面设计以桑叶蛋白提取率为响应值,以料液比(A)、浸提温度(B)、超声时间(C)和超声功率(D)4个影响因素为响应因素,利用Design Expert 10.0软件设计4因素3水平的响应面试验以优化桑叶蛋白提取工艺,Box-Behnken设计及结果见表2,方差分析见表3。
表2 桑叶蛋白提取响应面设计方案及结果

Table 2 Response surface design scheme and results of MLP extraction

编号
No.		 因素Factors 桑叶蛋白提取率
Extraction
rate of MLP/%
料液比
Solid-liquid
ratio (A)		 浸提温度
Leaching
temperature (B)		 超声时间
Ultrasound
time (C)		 超声功率
Ultrasonic
power (D)
1 -1 -1 0 0 18.174 7
2 1 -1 0 0 31.458 6
3 -1 1 0 0 20.421 3
4 1 1 0 0 30.099 4
5 0 0 -1 -1 28.310 2
6 0 0 1 -1 27.404 8
7 0 0 -1 1 26.341 2
8 0 0 1 1 9.012 1
9 -1 0 0 -1 28.541 0
10 1 0 0 -1 31.489 7
11 -1 0 0 1 17.370 6
12 1 0 0 1 26.073 1
13 0 -1 -1 0 26.769 2
14 0 1 -1 0 27.614 9
15 0 -1 1 0 21.028 3
16 0 1 1 0 24.138 9
17 -1 0 -1 0 25.139 2
18 1 0 -1 0 30.844 0
19 -1 0 1 0 14.107 1
20 1 0 1 0 28.795 3
21 0 -1 0 -1 28.006 6
22 0 1 0 -1 26.460 5
23 0 -1 0 1 24.476 0
24 0 1 0 1 23.274 9
25 0 0 0 0 30.392 3
26 0 0 0 0 33.890 4
27 0 0 0 0 32.259 5
28 0 0 0 0 29.392 6
29 0 0 0 0 32.869 9
表3 回归模型方差分析

Table 3 ANOVA of regression model

方差来源
Source of variance		 平方和
Sum of square		 自由度
DF		 均方
Mean square		 F值
F-value		 P值
P-value		 显著性
Significance
模型Model 862.52 14 61.61 10.55 <0.000 1 **
A 252.14 1 252.14 43.16 <0.000 1 **
B 0.37 1 0.37 0.06 0.805 9
C 136.91 1 136.91 23.43 0.000 3 **
D 158.89 1 158.89 27.20 0.000 1 **
AB 3.25 1 3.25 0.56 0.468 1
AC 20.18 1 20.18 3.45 0.084 3
AD 8.28 1 8.28 1.42 0.253 7
BC 1.28 1 1.28 0.22 0.646 6
BD 0.03 1 0.03 5.09×10-3 0.944 1
CD 67.43 1 67.43 11.54 0.004 3 **
A2 53.52 1 53.52 9.16 0.009 1 **
B2 56.31 1 56.31 9.64 0.007 8 **
C2 131.27 1 131.27 22.47 0.000 3 **
D2 83.68 1 83.68 14.32 0.002 0 **
残差Residual 81.79 14 5.84
失拟项Lack of fit 68.29 10 6.83 2.02 0.259 2
误差Error 13.50 4 3.37
总和Sum 944.30 28

A:料液比 solid-liquid ratio;B:浸提温度 leaching temperature;C:超声时间 ultrasound time;D:超声功率 ultrasonic power。

**表示差异极显著(P<0.01)。** indicated extremely significant differences (P<0.01).

利用Design Expert 10.0软件进行二次多元拟合分析,可得到料液比(A)、浸提温度(B)、超声时间(C)、超声功率(D)与桑叶蛋白提取率(Y)的关系。回归方程为Y=31.76+4.58×A+0.27×B-3.38×C-4.64×D-0.90×AB+2.25×AC+1.44×AD+0.57×BC+0.086×BD-4.11×CD-2.87×A2-2.95×B2-4.50×C2-3.59×D2,由方差分析可知,此模型极显著(P<0.01),失拟项不显著(P>0.05),决定系数(R2)=0.913 4,试验误差较少,故可用该模型桑叶蛋白提取率进行分析和预测。同时,通过方差分析可得到其中因素A、C、D、CD、A2、B2、C2和D2对桑叶蛋白提取率的影响极显著(P<0.01),加之通过F值的比较可以得出,各因素对桑叶蛋白提取率的影响大小依次为是料液比(A)>超声功率(D)>超声时间(C)>浸提温度(B)。

2.2.2 各因素间交互作用分析

为了更好地展示各因素之间的相互作用,作各个因素之间组合的响应面曲面图,如图6所示。因素间的交互作用对相应值的影响越强,则对应响应面曲面越陡峭,反之则越平缓。其中,C和D之间的响应面曲面表现得最为陡峭,这也侧面反映出超声时间和超声功率之间的相互作用对响应值的影响相较于其他因素间的交互作用更强。

2.2.3 最佳提取工艺的确定与验证

通过Box-Behnken优化分析,得到超声波辅助碱溶酸沉法提取桑叶蛋白的最佳工艺条件为:料液比1∶23.55、浸提温度30.62 ℃、超声时间4.88 min、超声功率235.19 W,在此条件下预测桑叶蛋白提取率为33.96%。为了方便验证,将验证试验条件修正为料液比1∶24、浸提温度30 ℃、超声时间4.9 min,超声功率235 W,此条件下的桑叶蛋白提取率为34.12%,理论值与实际值接近,说明此模型可靠,可用于桑叶蛋白提取率的分析与预测。

2.3 桑叶蛋白的抗氧化活性

为了探究桑叶蛋白的生物活性,本试验对桑叶蛋白的化学抗氧化能力进行了测定,结果如图7所示。桑叶蛋白表现出了优秀的化学抗氧化能力,且抗氧化活性在桑叶蛋白浓度为0.10~0.40 mg/mL时与浓度呈剂量正相关。值得注意的是,在0.05 mg/mL的浓度下,桑叶蛋白在还原力以及羟基自由基清除率方面与阳性对照抗坏血酸无显著差异(P>0.05);在0.40 mg/mL浓度下,桑叶蛋白的ABTS自由基清除率与阳性对照无显著差异(P>0.05);特别地,在0.10 mg/mL的浓度下,桑叶蛋白的羟基自由基清除率甚至显著优于阳性对照(P<0.05),达到(20.80±0.12)%。试验说明,桑叶蛋白具有很强的化学抗氧化能力,有进一步研究的价值。
图7 桑叶蛋白体外抗氧化活性试验结果

数据柱标记大写字母和小写字母分别代表同一种样品不同浓度间的差异性比较,不同字母代表差异显著(P<0.05);*表示同一浓度下不同样品间的差异性比较,*代表差异显著(P<0.05);n.s.表示无显著差异(P>0.05)。

Fig.7 Results of in vitro antioxidant activity assay of MLP

Data column labeled with uppercase and lowercase letters represented comparisons of differences between different concentrations of the same sample, respectively, and different letters represented significant difference (P<0.05); * denoted comparisons of differences between different samples at the same concentration, and * represented significant difference (P<0.05); n.s. mean no significant difference (P>0.05).

3 讨论

3.1 超声破碎辅助碱提法提取桑叶蛋白的效率

植物蛋白质提取方法众多,经典的方法有碱提法、Osborne法、酶解法以及有机溶剂萃取法等,其中碱提法工艺流程简单,适合大批量生产,是植物基蛋白质提取最常用的常规方法[13]。碱性环境会导致蛋白质中二硫键的断裂,从而提高蛋白质的溶解性,进而增加回收率和产率,最终实现比有机溶剂萃取法更高的蛋白质提取率[14];并且,由于酸性和中性氨基酸在高pH下的电离,蛋白质的溶解度也会随着溶剂pH的提高而提高[9]。在液体介质中,超声波会传播各种类型的物理力,诸如声流、空化、剪切、微射流和冲击波。这些有助于蛋白质细胞壁的破裂,释放出胞内蛋白质,并且能够减小蛋白质的粒度使其更易于溶解[10,15],最终提高蛋白质的提取效率。有研究表明,与常规提取相比,在超声处理期间产生的机械和空化效应导致藜麦、黑豆和小扁豆蛋白质的提取产率提高2倍[16]。本试验通过超声破碎辅助碱提法提取桑叶蛋白,并通过工艺优化获得了34.12%的提取率,明显高于傅海庆等[17]使用超声波-纤维素酶联合辅助法的16.06%,以及高于李刚凤等[18]使用的超声波辅助盐溶法的5.18%(以桑叶粉计),可见超声破碎辅助碱提法有一定的优势。对于提取条件,Dong等[19]采用超声波辅助提取油菜籽蛋白的最佳工艺条件为:提取时间80 min、超声功率450 W、料液比1∶20、提取温度25~35 ℃,此工艺下油菜籽蛋白提取率达到71.33%;蛋白质提取率在35~55 ℃下保持不变,然后在更高的温度下下降,这与本试验得到的现象结论类似。但是值得注意的是,吴尧等[20]通过碱提法以及后续优化,棉籽蛋白的提取率可到达80.22%。此外,Salgado等[21]使用碱提法从向日葵粉中提取蛋白质,优化条件为向日葵粉与水的比例67 g/L、提取时间1 h、碱液pH=9,实现了基于干重的70.4%的蛋白质回收率。由此表明,一方面,同一种提取方法对于不同植物蛋白质的提取效率差异明显;另一方面,碱提法仍有进一步优化的空间,值得进一步研究。
图6 双因素交互作用响应面

Fig.6 Response surface of two-factor interaction

3.2 桑叶蛋白具有极强的抗氧化活性

自由基因其化学性质活泼,在动物机体内参与一系列生理生化活动,自由基的稳态与机体健康关系密切,机体内的自由基的生成和清除一旦失衡,就会产生氧化应激[22]。人体或动物体细胞电子被抢夺即发生了氧化反应,是万病之源,氧化即意味着机体细胞或生物分子的损伤、变性、失活,氧化即意味衰老与疾病。还原力有着非常重要的生物学作用:1)可以促进物质的吸收和代谢,有助于维持机体内部稳定性,提高机体的整体抗压能力;2)对于机体的健康和生理活动具有重要作用,如能量释放、影响细胞生长发育、促进血液循环、改善免疫力或抗病力以及调节营养代谢等;3)是每一种生物体康复力、复原力和健康力的重要标志;4)是脂肪酸生物合成中的重要因素,脂肪酸链在不断延长的过程中,还原反应的持续进行必须有还原力的供应。在畜禽养殖生产活动中,氧化应激会导致多种疾病,如断奶仔猪猝死、母猪乳房炎、家禽肠道炎症和奶牛繁殖相关疾病等,从而会降低畜禽生产性能,增加养殖成本[23⇓⇓-26]。通过在畜禽饲粮中添加外源性抗氧化活性物质可以有效减少减轻畜禽氧化应激[27]。其中,天然抗氧化活性物质相较于人工合成抗氧化剂具有来源广泛、安全、副作用少及环保等优势[28]。在具有抗氧化能力的活性物质开发过程中,体外化学抗氧化评估方法操作简单、周期短,应用较为广泛[29]。也有研究指出,一些植物蛋白质具有很强的抗氧化性能[6]。因此,本试验进而使用化学抗氧化能力试验初步测定了桑叶蛋白的抗氧化活性,结果发现桑叶蛋白在0.40 mg/mL的浓度下对ABTS自由基、DPPH自由基、羟基自由基的体外清除率分别达到100.47%、74.92%和34.94 %,还原力达到0.43,优于其他相关研究。诸如杨明朗等[30]测定了芋艿蛋白对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力,其半抑制浓度(IC50)分别为0.398 7和0.496 3 mg/mL;刘乐等[31]发现,藜麦的醇溶蛋白在0.3 mg/mL的浓度下,对羟基自由基和ABTS自由基的清除能力分别为37.89%和98.21%。
本试验结果表明,桑蛋白具有极其显著的抗氧化活性,包括对羟基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除率以及极显著的还原力,因而在抗氧化天然产物开发利用上具有很强的竞争力与开发潜力,值得进一步探索其在细胞模型或动物模型中的抗氧化表现。除此以外,也有研究指出植物蛋白质经过体外酶解[32]、微生物发酵[33]等处理之后能够显著提高其生物活性。因此,在本试验提取桑叶蛋白的基础上,通过对其进一步处理与改造也有很大的研究潜力,进而为桑叶蛋白资源的开发利用提供空间。

4 结论

本研究采用超声破碎辅助碱溶酸沉法提取桑叶蛋白,通过单因素试验与Box-Behnken响应面法试验设计与优化,最终得到提取桑叶蛋白的最佳工艺为:液料比1∶24 (g/mL)、浸提温度30 ℃、超声时间4.9 min、超声功率235 W、浸提液pH=11、浸提时间60 min,在此条件下,桑叶蛋白的提取率可达到34.12%。在此条件下提取的桑叶蛋白表现出较强的自由基清除率与还原力,且呈浓度依赖关系。

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