我国农业农村部第194号公告要求自2020年1月1日起,饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料,因此高效替抗饲料添加剂的研发成为动物营养研究的热点。益生菌是对健康有益的微生物,动物生产中常用的益生菌包括乳杆菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属、片球菌属、丙酸杆菌属和酵母菌以及黑曲霉和米曲霉等[1]。益生菌具有促进动物肠道微生物区系平衡、增强肠道屏障功能、缓解机体炎症反应以及加强免疫应答等功能[2-4]。益生菌与宿主健康之间存在剂量相关性,其在生物体内充分发挥健康作用的前提是必须要在作用靶点保持足够的活菌数,不同益生菌推荐摄入量一般在107~1011 CFU/d[5]。但是,益生菌尤其是一些乳酸菌类益生菌抗逆性差,在菌种保存、饲料加工和胃肠消化等过程中极易受温度、氧气、pH和消化酶等体内外环境因素影响,导致其在到达作用靶点时已大量死亡,无法发挥其有益功能[6-7]。因此,开发安全稳定的益生菌递送载体,提升益生菌抗逆性正成为目前益生菌制剂的研发重点。
益生菌制剂加工技术指的是利用天然或者高分子材料通过物理化学等方法对益生菌进行包埋,通过在菌体外形成保护屏障以提升其稳定性,从而改善其使用性能。对益生菌进行制剂加工是提高其抗逆性的有效方法[8-9]。Ramirez-Olea等[10]使用麦芽糊精、海藻酸钠和菊粉组成复合壁材,采用喷雾干燥法对克劳氏芽孢杆菌进行了加工,结果表明,其在4、25和37 ℃环境下储存180 d后存活率仍可高达60%。Vimon等[11]研究表明,与饲粮中直接添加植物乳杆菌MB001相比,饲粮中添加包被处理的植物乳杆菌MB001制剂提升了肉鸡肠道中乳杆菌属和肠球菌属的数量,同时包被益生菌通过改善空肠组织形态结构和盲肠微生物群落等,提高了肉鸡对饲粮养分的吸收效率,促进了动物的生长。本文就益生菌制剂加工的方法及其在畜牧生产中的应用进行了综述,旨在为益生菌制剂加工技术进一步的开发与利用提供参考。
1 饲料中常用益生菌及其生物学特性
益生菌可以促进动物肠道健康、调节免疫反应以及改善生长性能,其作为抗生素替代品的价值与潜力已经取得了广泛的研究和证实[17]。益生菌在动物体内发挥功能的调控机制可能有以下几种:1)益生菌可以促进动物肠道有益菌的生长,抑制有害菌的繁殖,从而改善肠道菌群结构,调节动物消化系统和免疫系统的发育与功能,促进动物健康[14];2)益生菌可以通过调节肠上皮细胞信号转导分子、炎症和免疫相关因子的表达,菌株特异性和剂量依赖性调节免疫细胞等方式,诱导动物免疫调节;3)益生菌可以通过在肠道产生不利于病原微生物存活的微环境、产生抗微生物物质、消除细菌受体位点以及争夺病原体所需营养物质等机制,竞争性地减少肠道中的病原微生物,产生有益作用[18];4)益生菌可以促进动物肠道消化酶的合成与分泌以及营养转运蛋白的表达,提高动物肠道对营养物质的消化吸收能力,改善动物生长性能;5)益生菌通过对动物肠道微生物屏障、化学屏障、物理屏障以及免疫屏障的调控,维持动物肠道健康[19];6)益生菌可以靶向调节动物肠道微生物组,进而影响肠道微生物组的代谢物,包括对短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)、支链脂肪酸、多胺、次级胆汁酸、吲哚和酚类化合物,以及γ-氨基丁酸、多巴胺、5-羟色胺等各种神经递质的影响,从而促进动物的生长与健康[20];7)益生菌可以在分子水平上影响沉默信息调节因子2相关酶(silent information regulator factor 2-related enzymes,SIRTs)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等信号通路发挥抗氧化作用,以缓解动物的氧化应激,减少其肠道黏损伤和菌群失调的风险[21];8)益生菌可以通过调节茶氨酸、精氨酸以及3-羟基丁酸等血液代谢物水平,促进动物神经干细胞的增殖、神经发生以及新生神经元的成熟,对动物神经系统产生有益作用[22]。
2 益生菌制剂加工方法
2.1 喷雾干燥法
喷雾干燥法加工益生菌主要是依靠喷雾干燥机进行,该方法操作过程简单快捷、生产效率高、成本较低,是工业化加工益生菌制剂的主要方法之一。喷雾干燥法加工益生菌首先是将益生菌、壁材和保护剂等原材料制备成均匀的混合液或悬浮液,然后投入喷雾干燥机经喷嘴雾化成小液滴进入干燥室;干燥室含有流动热空气,小液滴在干燥室中快速失去水分,使壁材在益生菌表面形成干燥硬壳,将益生菌包封在内部。在此过程中,干燥室的空气流速、进/出口温度、雾化液滴的速率以及液滴固形物含量等因素都会对益生菌的成活率与包封效率造成影响。喷雾干燥法最明显的缺点就是其加工过程中的高温环境会对包封物质的活性造成损伤,这一缺点在益生菌的加工上更为突出。高温会导致益生菌细胞膜迅速脱水,从而损伤细胞膜蛋白和内部细胞器,影响益生菌正常代谢降低其储存活力[23]。因此,喷雾干燥法更加适用于对耐热性较强的益生菌进行加工,而想要提升益生菌在喷雾干燥过程中的成活率,可以通过复配新型隔热壁材、添加热损伤保护剂以及优化喷雾干燥条件等方法降低高温对益生菌的损伤[24]。
尽管喷雾干燥法容易对益生菌造成热损伤,但综合其产品的生产效率与应用效果,对一些耐受性较高的益生菌如粪肠球菌、丁酸梭菌和芽孢杆菌类等,依然是一种比较合适的益生菌制剂加工技术。Pupa等[25]使用相同壁材通过喷雾干燥法、乳化包被法和挤压包被法对乳酸菌进行了加工,发现3种制剂加工方法均可以提升乳酸菌的存活率与稳定性,且相互之间没有明显差异,但喷雾干燥法加工的乳酸菌粒径最小只有不足15 μm,更有利于乳酸菌在饲粮中的混合使用。国内外对喷雾干燥法加工益生菌已经取得了大量的研究进展,重点大多集中在对复合隔热壁材的研发上,以增强益生菌在高温加工中的存活率和长期储存时的生存能力。表1概述了一些喷雾干燥法加工的益生菌种类、壁材组合、粒径大小以及加工处理后对益生菌的作用效果[26-34]。
表1 喷雾干燥法加工益生菌Table 1 Probiotics processed by spray drying method |
| 菌株 Strains | 壁材 Wall material | 粒径 Grain size/μm | 作用效果 Action effects | 参考文献 References |
|---|---|---|---|---|
| 罗伊氏乳杆菌 Lactobacillus reuteri | 海藻酸钠/ 低聚半乳糖 | 18.5~42.9 | 增强菌储存期 稳定性与活力 | [26] |
| 发酵乳杆菌NCU001464 Limosilactobacillus fermentum NCU001464 | 明胶/低聚木糖 | 1~3 | 加工后活菌数保持在 9.78 lg(CFU/g) | [27] |
| 罗伊氏乳杆菌TF-7 Lactobacillus reuteri TF-7 | 乳清分离蛋白/ 淀粉纳米晶 | 4~20 | 巴氏灭菌后活菌数 仍有6 lg(CFU/g) | [28] |
| 嗜酸乳杆菌CRL1014等 Lactobacillus acidophilus CRL1014, etc | 海藻酸钠/菊 粉/麦芽糊精 | 10.06~11.72 | 冷藏后12个月仍可 保持足够活菌数 | [29] |
| 植物乳杆菌TH103 Lactobacillus plantarum TH103 | 抗性淀粉/ 乳清分离蛋白 | 19 | 胃肠模拟消化8 h活菌 数为8.92 lg(CFU/g) | [30] |
| 双歧杆菌ATCC27536等 Bifidobacterium ATCC27536, etc | 乳清蛋白/ 麦芽糊精 | 25 | 加工后活菌数保持 8.98 lg(CFU/g) | [31] |
| 戊糖乳杆菌ML82等 Lactobacillus pentosus ML82, etc | 牛干酪乳清/ 水牛干酪乳清 | 7.77~16.87 | 菌存活率约95% 且可长期储存 | [32] |
| 植物乳杆菌D-2 Lactobacillus plantarum D-2 | 菊粉/ 麦芽糊精 | 1~10 | 增强菌在储存 期的存活能力 | [33] |
| 鼠李糖乳杆菌ATCC53103 Lacticaseibacillus rhamnosus ATCC53103 | 亚麻籽饼 粕提取物 | 32.91~42.91 | 加工后活菌数仍有 8.64 lg(CFU/mL) | [34] |
2.2 冷冻干燥法
冷冻干燥法加工益生菌利用了冰晶升华的原理,最大程度降低了益生菌在干燥过程中的高温损伤,是一种能够较好的保持益生菌活性的制剂加工技术。冷冻干燥需要先将益生菌与壁材溶液混合均匀,并加入海藻糖、葡萄糖以及脱脂奶粉等组成的冻干保护剂,以缓解冷冻干燥过程中冰晶对益生菌造成的伤害,随后对此混合液在-30~-20 ℃温度下进行预冻,然后是真空环境下的初次干燥与二次干燥,最终得到粉末状益生菌制剂。冷冻干燥法与喷雾干燥法相比,可以较好地保持益生菌的活性,但一方面,冷冻干燥技术耗时长且能耗高,生产成本远高于喷雾干燥法;另一方面,冷冻干燥法生产的包埋外壳并非完整结构,而是疏松多孔的,长期储存时益生菌仍然会受到环境的威胁[30,35-36]。
对于植物乳杆菌、干酪乳杆菌和乳酸片球菌等大多数乳酸菌,冷冻干燥具有较好的保护效果,且生产的产品活性高、耐储存并易于溶解[37]。但也有研究表明,冷冻干燥技术对益生菌的保护效果并不强于喷雾干燥法,Azizi等[38]使用冷冻干燥法、喷雾干燥法以及电喷雾法对鼠李糖乳杆菌ATCC7469进行了加工,并在-18、4和25 ℃条件下各储存30 d发现,喷雾干燥法加工的菌活菌数下降最少,而另外2种方法加工的菌活菌数显著降低;在胃肠液模拟消化试验中,喷雾干燥法加工的菌也同样展现出更强的保护作用,这可能是因为冷冻干燥形成的保护屏障密封性不如喷雾干燥。虽然冷冻干燥法生产成本高,产品质量不易控制,但其操作简便,低温真空冷冻的加工环境又最大程度保持了益生菌活性,因此也被广泛地应用到益生菌的制剂加工中。
2.3 挤压包被法
挤压包被法也可称为锐孔凝固法,其生产成本低、操作过程简单,最重要的是挤压包被法加工环境温和,没有高温与有机溶剂等不利因素的影响,因此挤压包被法同样适用于对益生菌的制剂加工。挤压包被益生菌最经典的方法是海藻酸钠与氯化钙的交联,海藻酸钠与益生菌溶解混匀后,经注射器滴入氯化钙溶液中,海藻酸钠中的古洛糖醛酸与甘露糖醛酸上的钠离子(Na+)与溶液中的钙离子(Ca2+)等阳离子发生交换形成海藻酸盐,液滴表面的海藻酸盐形成网状凝胶结构从溶液中析出构成了微胶囊结构。不过,海藻酸盐形成的凝胶结构也并非完全密封,同样是一种疏松多孔的结构,这些微孔降低了凝胶对益生菌的保护作用,因此现在许多研究选择加入新的壁材如壳聚糖、菊粉和乳清蛋白等,利用不同材料的异性电荷彼此吸引形成更致密的网络结构,或对益生菌微胶囊进行二次涂层等,以加强凝胶结构的完整性与强度,提升对益生菌的保护效果[39-40]。
传统挤压包被法使用普通注射器对益生菌进行包被,生产效率低,仅适用于实验室的研究工作,难以满足工业化批次生产的要求,研发高效的电动多喷嘴等新型自动造粒仪器是目前挤压包被法应用的一大研究重点。目前已有研究静电挤出机和蠕动泵等电动挤出装备在包被技术中的应用,这些新型设备不仅可以大幅提高包被产品的生产效率,也在一定程度上改善了包被产品的质量[41-42]。挤压包被法操作简便,在克服微孔结构与生产效率等缺点后,势必会在益生菌的制剂加工中发挥更大的作用。Fathi等[43]研究了挤压包被法、喷雾干燥法和微乳包被法对假单胞菌菌株VUPF506的保护效果,发现挤压包被法加工过程温和,对益生菌活力保护效果最好。表2概述了一些挤压法包被益生菌种类、壁材组合、粒径大小以及包被处理后对益生菌的作用效果[44-50]。
表2 挤压法包被益生菌Table 2 Probiotics coated by extrusion method |
| 菌株 Strains | 壁材 Wall material | 粒径 Grain size/mm | 作用效果 Action effects | 参考文献 References |
|---|---|---|---|---|
| 鼠李糖乳杆菌等 Lacticaseibacillus rhamnosus, etc | 海藻酸钠/ 脱脂牛奶/壳聚糖 | 0.32~0.43 | 胆盐处理,活菌数 增加10 lg(CFU/mL) | [44] |
| 唾液链球菌LAB813 Streptococcus salivarius LAB813 | 海藻酸钠/ 壳聚糖 | 4~5 | 提升菌的生存能力和 储存活性 | [45] |
| 鼠李糖乳杆菌ATCC7469 Lacticaseibacillus rhamnosus ATCC7469 | 海藻酸钠/ 壳聚糖 | 2.0~3.5 | 胆盐处理,活菌数 增加1.27 lg(CFU/mL) | [46] |
| 植物乳杆菌F1等 Lactobacillus plantarum F1, etc | 海藻酸钠/壳聚 糖/海藻糖/菊粉 | 2.0~2.6 | 包被后菌存活率 最高达93.13% | [47] |
| 长双歧杆菌等 Bifidobacterium longum, etc | 海藻酸钠/ 蔗糖 | 2 | 提高菌存活率, 保持活性 | [48] |
| 罗伊氏乳杆菌LR2.2-1等 Lactobacillus reuteri LR2.2-1, etc | 海藻酸钠/ 壳聚糖 | 3.36~3.64 | 提升菌在模拟胃液 存活时间 | [49] |
| 乳酸克鲁维酵母B10 Kluyveromyces lactis B10 | 海藻酸钠/ 咖啡豆提取物 | 1.45~1.58 | 包被后活菌数 高于8.59 lg(CFU/mL) | [50] |
2.4 微乳包被法
微乳包被法加工环境温和且制备的包被产品粒径较小,同样是一种比较合适的益生菌制剂加工方法。微乳包被益生菌的过程通常有水包油(O/W)与油包水(W/O)2种形态,一般是先制备分散相溶液,即先将益生菌和壁材溶于水溶液或油脂中,然后加入作为连续相的油脂或水溶液中,随后加入乳化剂并高速搅拌;作为分散相的益生菌等以微液滴的形式分散在连续相中,最后通过加入交联剂等方法,使微液滴表面的壁材析出形成包被屏障,这种最后从外部加入交联剂而形成包被屏障的方法属于外源乳化法。但是,这种后期加入交联剂形成的屏障,由于连续相的阻隔等原因稳定性较差且容易成团聚集。因此,研究尝试一开始便将交联剂与益生菌等一起溶于分散相中,最后通过调节乳液的pH或温度等,使交联剂与壁材结合析出形成包被屏障,这种微液滴内部本身就含有交联剂的方法称为内源乳化法。相比于外源乳化法,内源乳化法包被的益生菌粒径小而均匀,包被效果也更好,在生产中更常被应用[51-52]。
相比于传统微乳包被法利用乳化剂降低溶液表面张力制备乳液的方式,以两亲性固体颗粒吸附在油水界面形成乳液的Pickering乳化法在乳液稳定性、胶囊密封性和环境友好性等方面都展现出更加优良的性能,是目前微乳包被益生菌的一种高效新兴方法。Pickering乳液是一种由固体颗粒作为稳定剂的乳液,与传统乳液相比,具有更好的可持续性、稳定性和生物相容性。固体颗粒之所以可以在溶液中起乳化稳定作用,是因为固体颗粒的润湿性,即被水相与油相分别润湿的能力,一般用接触角θ(水相、油相与固体颗粒的夹角)表示。陈云博[53]研究发现,当θ<90°时,固体颗粒亲水性较强,大部分浸没于水相中,形成水包油形Pickering乳液;当θ≈90°时,固体颗粒疏水性增强,在油水界面聚集且具有最高的解吸能,此时形成的Pickering乳液最稳定;当θ>90°时,固体颗粒疏水性较强,大部分浸没于油相中,形成油包水形Pickering乳液;当θ接近0或180°时,固体颗粒的疏水性或亲水性基本消失,只能被单一的水或油相润湿,不再具备乳化功能。
表3 微乳法包被益生菌Table 3 Probiotics coated by microemulsion method |
| 菌株 Strains | 乳化剂和壁材 Emulsifier and wall material | 作用效果 Action effects | 参考文献 References |
|---|---|---|---|
| 嗜酸乳杆菌LA-5 Lactobacillus acidophilus LA-5 | 吐温(Tween)80/抗性 淀粉/菊粉/米糠 | 25 ℃储存120 d,包被活菌数 提高3.56 lg(CFU/g) | [54] |
| 唾液乳杆菌CRL2217 Lactobacillus salivarius CRL2217 | Tween 80/大豆分离 蛋白/海藻酸钠 | 模拟肠消化包被菌活菌数 提高2.47 lg(CFU/mL) | [55] |
| 嗜酸乳杆菌等 Lactobacillus acidophilus, etc | 司盘(Span)80/卡 拉胶/海藻酸钠 | 储存28 d后包被菌活菌数 提高3.5 lg(CFU/g) | [56] |
| 副干酪乳杆菌CBA L74 Lactobacillus paracasei CBA L74 | Span 80/无水碳 酸钙/海藻酸钠 | 增强菌生产加工中的 生存能力与稳定性 | [57] |
| 植物乳杆菌NBRC15891 Lactobacillus plantarum NBRC15891 | 聚甘油酯蓖麻酸酯(PGPR)/ 豌豆分离蛋白/果胶 | 体外模拟消化菌存活率由 0.001 9%升至68.44% | [58] |
| 干酪乳杆菌TCS Lactobacillus casei TCS | Span 80/ β-环糊精 | 冻干37 ℃储存42 d,包被菌 存活率提高19% | [51] |
| 植物乳杆菌等 Lactobacillus plantarum, etc | PGPR/明胶/海藻 酸钠/黄蓍胶 | 63 ℃加热后包被菌活菌数 提高1.75 lg(CFU/mL) | [59] |
| 嗜酸乳杆菌NRRLB4495 Lactobacillus acidophilus NRRLB4495 | Tween 20/ 明胶/海藻酸钠 | 提升菌储存期间的稳定性 与抵抗能力 | [60] |
2.5 其他方法
流化床包被法通常是先借助淀粉等载体将益生菌制备成固体颗粒,或直接将菌液喷涂到固体颗粒上,然后用包被材料对固体颗粒进行喷涂干燥,其操作过程简单方便、生产成本低,易于在企业中大规模生产,因此流化床包被法也被广泛地应用到益生菌制剂的实际生产中,但其包被效果及应用效果缺少系统评价和研究[61]。
上述的几种制剂加工方法现在都经常被应用到实验室或者企业的益生菌制剂加工中,在市场对益生菌制剂质量要求不断提高的形势下,综合比较几种制剂加工方法,根据不同益生菌的生理特性选择合适的制剂加工方法,将是未来益生菌制剂加工的重要发展趋势,几种益生菌制剂加工方法的优劣比较见表4。除上述的几种常见的益生菌制剂加工方法以外,能够加工益生菌制剂的方法还有许多。例如,复凝聚法可以利用蛋白质和多糖等不同材料在特定的温度和pH环境下,带相反电荷产生静电作用而相互吸引形成包被屏障,其产品保护效果突出,包封率高[62];静电纺丝法通过施加强电场将注射器针头的液滴拉伸为圆锥形,并最终形成带电液流纤维喷射至带相反电荷的收集器上,该方法操作简便加工环境温和,可生产微米级的益生菌制剂,具有工业化批次生产的潜力[63]。虽然有许多方法都能对益生菌进行制剂加工处理,但是它们在加工工艺、生产成本、制备效率以及产品质量等多方面都还存在着较为明显的缺点,因此还没有在益生菌的制剂加工中得到广泛的应用,但随着科学技术的进步发展,这些方法一定能在未来的益生菌制剂加工中发挥更大的作用。
表4 益生菌制剂加工方法比较Table 4 Comparison of processing methods of probiotic preparations |
| 方法 Methods | 生产成本与效率 Production cost and efficiency | 加工环境 Manufacturing environment | 产品质量 Product quality | 参考文献 References |
|---|---|---|---|---|
| 喷雾干燥法 Spray drying method | 成本较低, 生产效率高 | 存在高温损伤与粉尘 | 菌存活率低, 适合耐热菌 | [24] |
| 冷冻干燥法 Freeze drying method | 设备成本与能耗高, 生产效率较低 | 低温真空环境 | 菌存活率高, 稳定性较强 | [35] |
| 挤压包被法 Extrusion coating method | 成本低,生产 效率较低 | 常温加工 | 产品粒径大, 密封性需加强 | [39] |
| 微乳包被法 Microemulsion coating method | 成本较高, 生产效率中等 | 温度可控,存在 乳化剂等化学品 | 产品粒径小, 稳定性良好 | [53] |
| 流化床包被法 Fluidized bed coating method | 设备成本较高, 生产效率高 | 温度可控, 存在粉尘 | 包被均匀,针对不同菌种 需采取不同包被参数条件 | [64] |
3 益生菌制剂在畜牧生产中的应用
3.1 益生菌制剂在家禽生产中的应用
益生菌经制剂加工后在饲料中长期储存时可保持良好活性,且在被动物采食后仍能以较高的存活率穿过上消化道到达肠道发挥功能。Zhang等[65]分别以微乳包被法和喷雾干燥法对粪肠球菌进行了加工,并以1×109 CFU/kg的剂量添加在肉鸡饲粮中,发现与直接饲喂粪肠球菌相比,2种方法加工的粪肠球菌均降低了肉鸡血清丙二醛含量,并提高了血清免疫球蛋白A含量;且微乳包被的粪肠球菌还提高了肉鸡血清抗氧化和免疫性能,增加了肉鸡盲肠中乳酸杆菌和粪肠球菌的数量,抑制了大肠杆菌等变形菌门(Proteobacteria)的生长,从而改善了动物的生产性能。研究表明,在肉鸡饲粮中直接添加未包被屎肠球菌会导致肉鸡肠道中屎肠球菌的数量急剧增加,从而对肠道上皮造成环境应激;而对屎肠球菌进行包被处理,使其具备了一定的缓释功能,从而减少了屎肠球菌的快速扩增对肠道上皮的负面影响[66]。Gyawali等[67]研究发现,在肉鸡饲粮中添加500 mg/kg包被副干酪乳杆菌提高了肉鸡所有肠段的绒毛高度(villus height,VH),并提高了十二指肠和空肠段绒毛高度/隐窝深度比值(VH/CD)以及闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)mRNA表达量,促进了肠道的屏障与吸收功能;同时,肠道白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)等抗炎因子表达的增强与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等促炎因子表达的下调,也证明了包被副干酪乳杆菌对肉鸡免疫功能的提升。
益生菌想要在动物肠道内长期稳定发挥有益作用,必须要保持足够数量定植在肠道黏膜并与跨膜蛋白作用发挥功能,而制剂加工技术为益生菌更多到达肠道提供了可能。Cui等[68]研究发现,在蛋鸡饲粮中添加1×109 CFU/kg包被植物乳杆菌可以提高蛋鸡第7、14和21天十二指肠、空肠和回肠的重量与长度,改善小肠的VH、隐窝深度(crypt depth,CD)和VH/CD,并增强植物乳杆菌在肠道中的定植,促进蛋鸡早期肠道发育;回肠黏膜转录组分析发现,植物乳杆菌在肠道黏膜的定植与差异表达基因溶质载体家族15成员1(SLC15A1)、LOC416086以及激活素A受体1C型(ACVR1C)等7个基因有关,这7个基因均编码菌定植相关跨膜蛋白,植物乳杆菌通过其代谢产物与SLC15A1、LOC416086和ACVR1C等菌跨膜蛋白的相互作用上调了这些基因的表达。研究表明,在蛋鸡饲粮中添加1×109 CFU/kg包被植物乳杆菌可以调控蛋鸡血液炎症因子表达,减缓脂多糖诱导的蛋鸡肠道炎症损伤;包被处理增强了菌的抗逆性,使到达肠道的植物乳杆菌大量增加,不仅改善了肠道菌群,还提高了肠道上皮功能细胞标志基因富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体-5(Lgr-5)、B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点-1(Bmi-1)和嗜铬粒蛋白A(ChA)等mRNA的表达量,并上调了c-Myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)以及Wnt-3等肠道上皮干细胞增殖分化的关键基因表达,促进了肠道上皮干细胞的增殖分化,从而减轻蛋鸡肠道损伤[69]。目前,针对包被益生菌制剂对家禽影响的研究基本都在肉鸡和蛋鸡养殖业中,且只探究了粪肠球菌和植物乳杆菌等少数几种益生菌制剂的影响,还有大量的益生菌有待进行制剂加工试验,并探索其有益功能与作用机制。
3.2 益生菌制剂在猪生产中的应用
仔猪早期断奶后易受营养、心理和环境等因素影响而导致断奶后腹泻(postweaning diarrhea,PWD),其肠道健康一直是猪生产中的重要问题。益生菌制剂对肠道健康有积极的调控作用,在断奶仔猪饲粮中补充包被益生菌添加剂可能是解决PWD的有效方法。Pupa等[70]通过给新生仔猪分别多次人工灌服多菌株益生菌微胶囊以及乳酸片球菌微胶囊,并在断奶后7 d进行产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)攻毒试验,验证益生菌微胶囊对感染ETEC导致断奶仔猪PWD的缓解能力,结果表明,多菌株益生菌微胶囊缓解ETEC感染的效果更好,多菌株益生菌可以降低促炎因子白细胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)和TNF-α含量,提高抗炎因子IL-10含量,改善仔猪肠道微生物群结构以及VH和VH/CD,且提高断奶仔猪的平均日增重和饲料转化率,改善生产性能。Li等[71]研究发现,与其他试验组相比,断奶仔猪饲粮中添加包被鼠李糖乳杆菌(日剂量3.5×108 CFU/头)和牛初乳复合物(日剂量10 g/头)的试验组,在断奶后10 d内增重幅度更高,且对仔猪肠道微生物群的调控更加明显,这可能是因为包被鼠李糖乳杆菌与牛初乳复合物在对断奶仔猪的营养调控上存在互补作用。Wang等[72]研究发现,断奶仔猪饲喂1.2×1010 CFU/kg包被罗伊氏乳杆菌后,核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)和MAPK信号通路受到抑制,从而减弱了鼠伤寒沙门氏菌诱导的肠黏膜炎症因子的产生,维持了肠道黏膜屏障功能。研究表明,包被的乳酸菌可以通过调节肠道微生物,改善肠道形态结构,从而在猪的生长育肥中展现出与抗生素相似水平的促生长功能,这验证了包被益生菌产品在畜牧生产中替代抗生素的有效性[73]。综上所述,益生菌制剂可以作用于仔猪肠道有效缓解其早期断奶后的腹泻问题,但目前有关益生菌制剂对猪生产、免疫和抗氧化性能的系统性研究较少,其作用调控机制都还有待进一步研究。
3.3 益生菌制剂在反刍动物生产中的应用
环境与营养状况变化引起的胃肠道微生物失衡而导致的消化和腹泻问题,同样是反刍动物哺乳期高死亡率的重要诱因之一,因为反刍动物出生后还未建立完整稳定的微生物群落,所以在反刍动物哺乳期补充益生菌制剂可能对其胃肠系统提供良好的保护作用。Yadav等[74]在给犊牛提供基础饲粮的同时,给犊牛补充以脱脂牛奶为载体稀释的罗伊氏乳杆菌微胶囊[108 CFU/(头·d)],发现可以增加肠道乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌数量,提高肠道SCFAs含量,减少大肠杆菌等致病菌数量,降低犊牛平均粪便稠度指数,维护肠道健康。在杜寒羊饲粮中添加包被嗜酸乳杆菌,可能通过促进消化酶分泌、改善物质代谢能力、提高营养物质利用率等,提高杜寒羊生长性能、屠宰性能和肉品质[75]。目前,有关益生菌在反刍动物中的应用研究基本都是采取在饲粮中直接添加或定量饲喂的方式,这可能是因为反刍动物复杂的瘤胃环境对益生菌制剂的使用造成了较大的障碍,想要使益生菌制剂较完整的通过瘤胃到达肠道发挥功能,这对益生菌制剂的屏障结构、溶解度和稳定性都提出了较高的要求,研发具备过瘤胃功能的益生菌制剂或许会成为未来益生菌制剂加工技术的研究热点。
4 小结与展望
益生菌制剂加工技术可以提高其抗逆性。目前,在益生菌制剂的加工方法中,应用较为广泛的有喷雾干燥法、冷冻干燥法、挤压包被法、微乳包被法以及流化床包被法等方法。制剂加工技术对益生菌提供了良好的保护作用,使得益生菌长期储存后仍能保持较高的活菌数,并能够通过动物上消化道在肠道发挥有益功能。在畜牧生产中,与未进行包被加工的益生菌比较,包被的益生菌制剂展现出良好的促生长功能,并提高了畜禽的健康水平。但是,每种益生菌的理化特性各不相同,目前关于不同益生菌特性的系统性制剂加工技术研究较少,并且缺乏关于益生菌制剂效果的有效评价体系。因此,开发更加高效简便低成本的制剂加工方法和更加稳定的复合壁材以对益生菌提供保护,建立统一的益生菌制剂效果评价体系等,可能是今后益生菌制剂加工技术的研究重点。此外,有关益生菌制剂在畜牧生产中的应用研究还十分缺乏,其发挥生理功能的具体机制也还有待进一步研究。