Chinese Journal of Animal Nutrition >

2026 , Vol. 38 >Issue 9: 7132 - 7147

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.568

RESEARCH PAPER

Effects of Adding Three Kinds of Agricultural By-Product Residues on Silage Quality, Active Components and Microbial Community Structure of Forage Mulberry

  • TIAN Shimin ,
  • SUN Hong , * ,
  • ZHOU Tong ,
  • LEI Xingcheng ,
  • LUO Yimei ,
  • OU Yangwen ,
  • ZHAO Chengxi ,
  • YANG Fuyu
Expand
  • College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China
* associate professor, E-mail:

Received date: 2026-04-17

  Online published: 2026-09-12

Fold

Abstract

This experiment was conducted to investigate the effects of adding three kinds of agricultural by-product residues (Galla chinensis, Rosa roxburghii and Pueraria lobata root residues) on the silage quality, active components and microbial community structure of forage mulberry. Four treatments were designed, including one control group (CK treatment) and three residue-added groups. The CK treatment received no addition, while the three residue-added groups were supplemented with Galla chinensis residues (RC treatment), Rosa roxburghii residue (CL treatment) and Pueraria lobata root residue (PL treatment), respectively. For each residue, four addition levels were set: 1.25%, 2.50%, 5.00% and 10.00% (based on the fresh weight of forage mulberry). The dried and ground Galla chinensis, Rosa roxburghii or Pueraria lobata root residues were added to 300 g of forage mulberry at the set ratios for bag silage. Each treatment had five replicates. After 60 days, samples were collected to analyze the nutritional components, active components, fermentation quality and microbial community structure of the forage mulberry silage. The results showed that compared with the CK treatment, the addition of three kinds of agricultural by-product residues increased the dry matter (DM) content of forage mulberry silage, and the DM content increased with increasing addition levels of each residue. The crude protein (CP) content in the 10.00% RC treatment was significantly higher than that in the CK treatment (P<0.05). The neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) contents in the CL, PL and RC treatments were generally higher than those in the CK treatment. The water-soluble carbohydrates (WSC) and total flavonoids (TF) contents in the CL treatment were generally higher than those in the other treatments. The lactic acid (LA) content was higher in the RC treatment, while it was lower in the CL treatment. Compared with the CK treatment, the acetic acid (AA) content was reduced in all residue-added treatments. The ammonia nitrogen (NH3-N) content in all residue-added treatments, except for the 5.00% RC treatment, was significantly lower than that in the CK treatment (P<0.05). The pH in the PL treatment at all addition levels were generally higher, ranging from 4.46 to 4.54. The propionic acid (PA) content in the PL treatment gradually increased with increasing addition levels and was higher than that in the CK treatment at all addition levels. The V-score evaluation indicated that the fermentation quality of all residue-added treatments was superior to that of the CK treatment. The dominant bacterial genera in all treatments were Enterobacter and Enterococcus; compared with the CK treatment, the relative abundance of Lactiplantibacillus was significantly increased in the 1.25% RC, 1.25% CL and 10.00% CL treatments (P<0.05). Mantel test revealed that TF and organic acid contents were the key factors driving the succession of microbial community structure. In conclusion, the addition of all three agricultural by-product residues can increase the DM and NDF contents and reduce NH3-N production of forage mulberry silage. The addition of Galla chinensis residue also can increase the CP content and maintain stable fermentation of forage mulberry silage, with an optimal addition level of up to 10.00%. In contrast, although the addition of Rosa roxburghii residue enhances the WSC and TF contents of forage mulberry silage, high addition levels decrease the LA content and the relative abundance of lactic acid bacteria; therefore, its addition level should be controlled within 2.50%.

Key words： Galla chinensis residue; Rosa roxburghii residue; Pueraria lobata root residue; forage mulberry silage; silage quality; active components; microbial community

Cite this article

TIAN Shimin , SUN Hong , ZHOU Tong , LEI Xingcheng , LUO Yimei , OU Yangwen , ZHAO Chengxi , YANG Fuyu . Effects of Adding Three Kinds of Agricultural By-Product Residues on Silage Quality, Active Components and Microbial Community Structure of Forage Mulberry[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2026 , 38(9) : 7132 -7147 . DOI: 10.12418/CJAN2026.568

随着我国畜牧业集约化、规模化的快速发展,优质饲草资源短缺及人畜争粮矛盾日益突出。非常规饲料资源(如果渣、药渣等农业副产物残渣)富含碳水化合物和蛋白质,且多含具抗氧化、抗菌、抗炎及促生长活性的生物活性物质,在替代抗生素方面潜力巨大,因此,实现此类农业副产物残渣的饲料化利用,对缓解优质饲草供给压力、有效控制养殖成本具有重要现实意义。
贵州喀斯特地区特色农业资源丰富,五倍子(Galla chinensis)、刺梨(Rosa roxburghii)及葛(Pueraria lobata)在精深加工过程中产生大量副产物。五倍子渣为五倍子提取单宁后的残余物,仍保留较高水平的水解单宁,研究证实单宁不仅具有抗氧化、抗炎及抗菌活性[1],还能与蛋白质和多糖形成复合物[2]。刺梨渣是刺梨果汁加工的主要副产物,含果肉、果皮及种子,富含多糖、维生素C、超氧化物歧化酶、黄酮类化合物和膳食纤维等活性成分[3]。葛根作为药食同源植物葛的地下块根,其药用煎煮残渣中仍保留葛根素等黄酮类化合物,具有抗氧化与免疫调节活性[4]。然而,目前上述残渣多被废弃或填埋,利用率低下,不仅造成资源浪费,亦对生态环境构成潜在威胁。
青贮发酵是缓解季节性饲草短缺、改善饲草品质的关键技术,其核心是利用乳酸菌发酵降低体系pH,促进活性成分释放,从而提高饲草营养价值并抑制有害菌增殖[5]。已有研究表明,添加葡萄渣、苹果渣、刺梨渣、枸杞渣、酒糟及药渣等农业副产物残渣,可改善苜蓿(Medicago sativa)和构树(Broussonetia papyrifera)青贮的营养组成、发酵品质及抗氧化能力,并调控青贮过程中的微生物群落组成[6-8]。然而,关于五倍子渣和葛根渣在青贮饲料中应用的研究,目前尚未见报道。
不同于传统的糖类或化学酸类青贮添加剂,农业副产物残渣中的活性成分复杂,这类成分不仅能抑制有害菌的生长,部分还可能作为益生元底物或氧化还原调节剂,改变微生物发酵过程的代谢途径[9]。然而,现有研究多将农业副产物残渣以湿态形式添加到饲草中进行青贮[8],由于不同残渣的水分含量差异较大,直接添加会改变青贮体系的干物质(DM)含量、发酵底物构成和活性成分含量,难以厘清残渣添加引起青贮饲料营养成分和微生物群落结构变化的核心驱动因素[10]。因此,将农业副产物残渣干燥粉碎,以等DM基础进行添加,可排除水分含量差异带来的干扰,明确不同农业副产物残渣中物质成分对青贮过程营养成分和微生物组成的调控作用[7]。
饲料桑(Morus alba)作为一种优质木本饲料,因其粗蛋白质(CP)、可消化粗纤维含量高,被广泛用于缓解蛋白质饲料短缺。然而,饲料桑多在雨季收获,水分含量高,且具有较高的缓冲能值,加之表面附着的乳酸菌数量较少 $\left[5.0\right.\mathit{ }\mathit{l}\mathit{o}{\mathit{g}}_{10}{(\mathit{C}\mathit{F}\mathit{U}/\mathit{g}\mathit{ }\mathit{F}\mathit{M})]}^{\left[11\right]}$,直接青贮易出现pH下降缓慢,梭菌属(Clostridium)等腐败菌大量繁殖,营养物质严重流失及丁酸积累等现象。因此,将富含营养成分和活性成分的农业副产物残渣添加到饲料桑中进行青贮,是提高农业副产物残渣的利用效率和饲料桑青贮品质的有效途径。
因此,本研究选取五倍子渣、刺梨渣、葛根渣3种农业副产物残渣,经干燥粉碎后以不同水平添加到饲料桑中进行青贮,通过系统分析其营养成分含量、发酵品质和活性成分含量变化,并结合微生物群落构成特征,阐明不同农业副产物残渣对饲料桑青贮品质、活性成分与微生物群落的作用机制,并在此基础上筛选可有效提升饲料桑青贮品质的农业副产物残渣类型和添加水平,为贵州喀斯特地区农业废弃物资源化利用开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用饲料桑原材料取自贵州省遵义市播州区,该地区年平均温度15.3 ℃,年降雨量1 094.2 mm。于2024年7月13日由人工刈割收获饲料桑,刈割高度为1.2 m,留茬高度为10 cm。本试验所用刺梨渣、五倍子渣和葛根渣3种农业副产物残渣,分别采集自贵州省龙里县刺梨加工企业、遵义市倍缘化工厂及贵阳市花溪区中医院。将以上3种农业副产物残渣干燥并粉碎后低温真空保存。3种农业副产物残渣和饲料桑的原料特性如表1所示。
表1 3种农业副产物残渣和饲料桑的原料特性

Table 1 Raw material characteristics of agricultural by-product residues and forage mulberry

项目
Items		 五倍子渣
Galla chinensis
residue		 刺梨渣
Rosa roxburghii
residue		 葛根渣
Pueraria lobata
root residue		 饲料桑
Forage
mulberry
干物质DM/(g/kg FM) - - - 352.80±0.74
粗蛋白质CP/(g/kg DM) 141.41±1.13 76.35±0.52 61.20±2.26 127.53±0.47
水溶性碳水化合物WSC/(g/kg DM) 19.17±2.07 106.97±6.61 54.84±10.02 100.67±0.91
中性洗涤纤维NDF/(g/kg DM) 182.86±9.46 322.91±9.35 588.42±18.43 374.35±6.93
酸性洗涤纤维ADF/(g/kg DM) 98.76±6.86 170.15±0.40 262.37±4.00 165.17±2.00
水解单宁HC/(g/kg DM) 84.10±3.32 152.76±9.64 326.05±16.75 209.18±4.24
总酚TP/(g/kg DM) 8.59±0.24 14.20±0.27 6.79±0.16 12.13±1.09
总黄酮TF/(g/kg DM) 20.03±0.86 99.16±18.89 32.38±1.71 21.31±3.49
乳酸菌LAB/[log10(CFU/g FM)] - - - 3.88±0.17
大肠杆菌E. coli/[log10(CFU/g FM)] - - - 4.03±0.21
霉菌Molds/[log10(CFU/g FM)] - - - 2.00±0.01
酵母菌Yeast/[log10(CFU/g FM)] - - - ND

-表示未检测,ND表示未检出。

- means undetected, and ND means not detected.

1.2 试验设计

饲料桑收获后,经粉碎机切割至2~3 cm长度。将粉碎后的饲料桑充分混匀,采用小规模袋装青贮方式制备青贮饲料。试验设置1个对照处理(CK处理)和3个添加残渣处理。其中,CK处理无添加,3个添加残渣处理分别添加五倍子渣(RC处理)、刺梨渣(CL处理)和葛根渣(PL处理),每种残渣设置4个添加水平:1.25%、2.50%、5.00%和10.00%(以饲料桑鲜重为基础)。准确称取300 g饲料桑样品,按各处理设计加入相应水平的农业副产物残渣,充分混匀后迅速装入青贮真空包装袋(30 cm×40 cm×0.32 mm)中密封,每个处理设置5个重复。所有青贮袋于室温条件(18~27 ℃)下保存,青贮发酵60 d后开袋取样,用于青贮品质评价和微生物群落分析。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 营养成分和发酵品质测定

营养成分测定:取约200 g新鲜饲料桑原料和青贮样品,分别装入牛皮纸袋,于65 ℃烘箱中烘至恒重,测定DM含量。将粉碎后的烘干样品过40目筛,收集筛下物用于后续营养成分分析。其中,CP含量采用杜马斯燃烧法[12]测定;中性洗涤纤维(NDF)和酸洗洗涤纤维(ADF)含量采用范氏纤维分析法[13]测定;水溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法[14]测定。
发酵品质测定:精准称取10 g的新鲜饲料桑原料和青贮样品,加入90 mL无菌水,放置于4 ℃条件下浸提24 h。经4层医用纱布过滤后得到浸提液,使用pH计(雷磁PHSJ-3F,上海仪电科学仪器股份有限公司)测定浸提液的pH。使用0.22 μm微孔滤膜过滤浸提液后使用高效液相色谱仪(Vanquish Core,赛默飞,美国)测定乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量。色谱条件:Shodex Rspark KC-811色谱柱,3 mmol/L高氯酸溶液为流动相,柱温50 ℃,检测波长210 nm,流速1.0 mL/min。氨态氮(NH3-N)含量参照文献[15]采用苯酚-次氯酸钠比色法测定。

1.3.2 活性成分测定

总酚(TP)含量的测定:按GB/T 8313—2018所述,用70%的甲醇对饲料桑原料和青贮样品进行酚类物质提取。取适量提取液,加入10%的福林酚溶液和7.5%的碳酸钠溶液进行显色反应,于765 nm波长下测定吸光度值,通过没食子酸标准液所得标准曲线计算样品总酚含量。
总黄酮(TF)含量的测定:按SZDB/Z 349—2019所述,用60%的甲醇对饲料桑原料和青贮样品进行黄酮类物质提取。取适量提取液,加入亚硝酸钠、硝酸铝溶液和氢氧化钠进行络合显色反应,于510 nm波长下测定吸光度值,通过芦丁标准液所得标准曲线计算样品总黄酮含量。

1.3.3 V-score分析

采用日本草地畜产协会(2001)制定的青贮饲料发酵品质V-score评价体系[16],根据所测青贮饲料中NH3-N和挥发性脂肪酸含量评定发酵品质的优劣,满分为100分。将青贮饲料划分为3个等级,分别为良好(>80分)、尚可(60~80分)和不良(<60分),V-score评分标准[17]如表2所示。
表2 V-score评分标准

Table 2 V-score evaluation standard[17]

氨态氮NH3-N/% TN 乙酸+丙酸AA+PA/% FM 丁酸BA/% FM V-score
XN 计算公式
Computational formula		 XA 计算公式
Computational formula		 XB 计算公式
Computational formula
XN≤5 YN=50 XA≤0.2 YA=10 0<XB≤0.5 YB=40-80XB




Y=YN+YA+
YB
5<XN≤10 YN=60-2XN 0.2<XA≤1.5 YA=(150-
100XA)/13		 XB>1.5 YB=0
10<XN≤20 YN=80-4XN XA>1.5 YA=0
XN>20 YN=0

1.3.4 微生物群落分析

使用细菌DNA提取试剂盒提取新鲜饲料桑原料及青贮样品的基因组DNA,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA的完整性。选用引物对341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R(5'-GGACTACNNGGGTWTCTAAT-3')扩增细菌16S rDNA的V3~V4区。PCR反应体系(20 μL)采用TransStart Fastpfu DNA聚合酶,扩增程序为:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共30个循环;最后72 ℃延伸10 min。每个样品设置3个重复。扩增产物委托广东美格基因科技有限公司在Illumina HiSeq平台上进行高通量测序。
测序数据处理和分析:使用FLASH软件对双端测序读段(PE reads)依据重叠区(overlap)进行拼接,并对拼接序列进行质量控制和过滤。使用UPARSE 7.1软件,以97%的相似性对非重复序列进行操作分类单元(OTUs)聚类,进而分析微生物的Alpha多样性及群落结构。

1.4 数据统计与分析

使用Excel 2019和SPSS 25进行数据整理与统计分析。结果以平均值和均值标准误(SEM)表示。采用双因素方差分析(two-way ANOVA)评价农业副产物残渣类型及添加水平对饲料桑青贮品质的影响,13个处理间差异采用Tukey多重比较法进行检验。采用Mantel检验分析微生物群落结构、群落功能和OTUs特征与环境因子矩阵的相关性。使用Origin 2021和GraphPad Prism 9绘图,并计算数据间的显著性。P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 添加不同水平的3种农业副产物残渣对饲料桑青贮营养成分和活性成分的影响

由表3可知,随着各残渣添加水平的升高,饲料桑青贮DM含量整体呈上升趋势,均在添加水平为10.00%时达到最大。10.00% RC处理的CP含量显著高于CK处理(P<0.05),而10.00% CL和10.00% PL处理的CP含量则较CK处理显著下降(P<0.05)。CL、PL和RC处理的NDF和ADF含量整体高于CK处理,其中以10.00% PL处理的NDF含量最高。RC和CL处理的WSC含量随着添加水平的升高而增加,当添加水平达到10.00%时,其WSC含量达到最高。
表3 添加不同水平的3种农业副产物残渣对饲料桑青贮营养成分和活性成分的影响

Table 3 Effects of adding different levels of three agricultural by-product residues on nutritional components and active components of mulberry silage

项目
Items		 添加水平
Addition
levels/%		 干物质
DM/
(g/kg FM)		 粗蛋白质
CP		 中性洗
涤纤维
NDF		 酸性洗
涤纤维
ADF		 水溶性碳水
化合物
WSC		 总黄酮
TF		 总酚
TP
CK处理
CK treatment		 0 321.08 144.59b 288.12g 139.51 8.77bcd 19.79d 16.29ab
RC处理
RC treatment		 1.25 324.45 146.70ab 297.50fg 146.30 8.57bcd 21.78cd 15.80ab
2.50 326.88 143.85b 305.20efg 153.99 9.18bcd 21.87cd 16.35ab
5.00 340.32 146.39ab 289.49g 145.11 9.00bcd 20.30d 15.90ab
10.00 366.72 152.39a 303.13efg 153.06 10.51b 19.31bcd 14.37b
均值标准误SEM 4.445 1.768 10.391 5.041 0.740 1.363 0.561
CL处理
CL treatment		 1.25 326.31 143.90b 368.55ab 177.78 9.33bc 20.42d 16.05ab
2.50 321.19 142.34b 348.36bcd 170.49 9.11bcd 26.47bc 18.45a
5.00 346.05 146.97ab 321.19defg 164.24 10.34b 28.41b 17.46ab
10.00 377.02 129.66d 356.57bcd 175.99 14.60a 36.72a 17.94ab
均值标准误SEM 10.171 3.460 17.327 8.122 1.181 3.077 0.628
PL处理
PL treatment		 1.25 299.00 143.12b 338.08bcde 168.46 7.20d 18.87d 15.97ab
2.50 315.61 148.80ab 327.87cdef 166.34 8.01cd 18.27d 16.42ab
5.00 331.54 136.35c 364.67abc 177.23 7.34cd 19.47d 16.33ab
10.00 369.85 134.45cd 395.56a 190.87 13.13a 22.44bcd 14.87b
均值标准误SEM 12.315 3.258 19.260 9.087 1.108 0.934 0.518
P值P-value
处理Treatment (T) <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
添加水平Addition level (L) <0.001 0.003 0.034 0.067 <0.001 <0.001 <0.001
处理×添加水平T×L 0.057 <0.001 0.008 0.131 0.006 <0.001 <0.001

同列数据肩标不同小写字母表示存在显著差异(P<0.05)。下表同。

Values with different lowercase letter superscripts in the same column indicate significant difference (P<0.05). The same as below.

与CK处理相比,各添加水平的RC和PL处理的TF含量无显著差异(P>0.05),2.50%、5.00%和10.00% CL处理的TF含量则显著提高(P<0.05),且其TF含量随添加水平的升高而增加。2.50% CL处理的TP含量最高,显著高于10.00% RC和10.00% PL处理(P<0.05)。

2.2 添加不同水平的3种农业副产物残渣对饲料桑青贮发酵品质的影响

由表4可知,各添加水平的RC和CL处理的pH均低于CK处理,但差异未达显著水平(P>0.05);各添加水平的PL处理的pH整体偏高,介于4.46~4.54。与CK处理相比,所有添加残渣处理的AA含量均有所降低,且PL和RC处理的AA含量随添加水平的升高而逐渐下降。RC处理的LA含量较高,而CL处理的LA含量相对最低。在1.25%和2.50%添加水平下CL处理有较高的PA含量,但在5.00%和10.00%添加水平下未检测出PA;相反,PL处理的PA含量则随着添加水平的升高而逐渐增加。所有添加残渣处理的NH3-N含量均低于CK处理,除5.00% RC处理与CK处理无显著差异(P>0.05)外,其余处理均显著低于CK处理(P<0.05);此外,添加相同残渣的不同添加水平间NH3-N含量差异不显著(P>0.05)。所有处理中均未检测到BA。
表4 添加不同水平的3种农业副产物残渣对饲料桑青贮发酵品质的影响

Table 4 Effects of adding different levels of three agricultural by-product residues on fermentation quality of mulberry silage

项目
Items		 添加水平
Addition
levels/%		 pH 乳酸
LA/
(g/kg DM)		 乙酸
AA/
(g/kg DM)		 丙酸
PA/
(g/kg DM)		 丁酸
BA/
(g/kg DM)		 氨态氮
NH3-N/
(g/kg DM)
CK处理CK treatment 0 4.42abcd 31.66ab 4.13a 0.89abc ND 0.31a



RC处理RC treatment		 1.25 4.35cd 32.46a 3.84ab 1.38abc ND 0.20b
2.50 4.39bcd 30.87abc 3.42bc 1.52abc ND 0.23ab
5.00 4.36cd 31.79ab 3.10cd 1.04abc ND 0.22b
10.00 4.36cd 31.35abc 2.75de 0.28bc ND 0.21b
均值标准误SEM 0.020 0.823 0.249 0.612 - 0.023
CL处理CL treatment 1.25 4.34cd 23.06de 2.64de 3.81 ND 0.18b
2.50 4.37cd 23.10de 2.80cde 3.16 ND 0.20b
5.00 4.33cd 21.63e 3.09cde ND ND 0.22b
10.00 4.32d 19.83e 3.17 ND ND 0.16b
均值标准误SEM 0.029 2.120 0.262 0.968 - 0.032
PL处理PL treatment 1.25 4.46abc 27.43bcd 3.45bc 0.93abc ND 0.20b
2.50 4.54a 26.64cd 3.10cd 1.73abc ND 0.18b
5.00 4.50ab 27.65bcd 2.44ef 2.64abc ND 0.18b
10.00 4.52a 21.45e 1.86f 3.73a ND 0.19b
均值标准误SEM 0.035 1.633 0.384 0.778 - 0.025
P值P-value
处理Treatment (T) <0.001 <0.001 <0.001 0.077 - 0.121
添加水平Addition level (L) 0.178 <0.001 <0.001 - - <0.001
处理×添加水平T×L 0.012 <0.001 <0.001 <0.001 - 0.401

-表示无此项,ND表示未检出。表5同。

- means not applicable, and ND means not detected. The same as Table 5.

2.3 饲料桑青贮发酵品质的V-score评价

由表5可知,除CK处理外,所有添加残渣处理的V-score均在80分以上,属于良好。其中,RC、CL处理均在添加水平为10.00%时V-score最高,分别为92.14、93.06;PL处理在添加水平为2.50%的V-score最高,为92.34。从不同残渣进行评价,CL处理的平均V-score最高;从不同添加水平进行评价,10%添加水平的平均V-score最高。
表5 饲料桑青贮发酵品质的V-score

Table 5 V-score of fermentation quality of mulberry silage

项目
Items		 添加水平
Addition
level/%		 氨态氮NH3-N 乙酸+丙酸AA+PA 丁酸BA V-score 等级
Grade		 排名
Rank
含量
Content/
% TN		 得分
Score		 含量
Content/
% FM		 得分
Score		 含量
Content/
% FM		 得分
Score
CK处理
CK treatment		 0 13.45 26.20 0.52 7.55 ND 40 73.75 尚可 13
RC处理
RC treatment		 1.25 8.72 42.56 0.54 7.39 ND 40 89.95 良好 8
2.50 10.06 39.76 0.51 7.61 ND 40 87.37 良好 12
5.00 9.22 41.56 0.43 8.24 ND 40 89.80 良好 9
10.00 8.49 43.02 0.31 9.12 ND 40 92.14 良好 3
CL处理
CL treatment		 1.25 7.67 44.66 0.67 6.39 ND 40 91.05 良好 5
2.50 9.00 42.00 0.62 6.81 ND 40 88.81 良好 11
5.00 9.26 41.48 0.32 9.08 ND 40 90.56 良好 6
10.00 7.97 44.06 0.33 9.00 ND 40 93.06 良好 1
PL处理
PL treatment		 1.25 8.91 42.18 0.45 8.07 ND 40 90.25 良好 7
2.50 7.63 44.74 0.51 7.60 ND 40 92.34 良好 2
5.00 8.07 43.86 0.55 7.34 ND 40 91.20 良好 4
10.00 8.98 42.04 0.61 6.87 ND 40 89.91 良好 10

2.4 添加不同比例的3种农业副产物残渣对饲料桑青贮微生物群落结构的影响

3种农业加工副产物残渣及其添加水平对饲料桑青贮微生物群落Alpha多样性的影响如表6所示。与CK处理相比,除1.25% RC及5.00% PL处理外,其他添加残渣处理的OTUs数量均降低。与CK处理相比,除1.25% RC、5.00%PL和10.00% PL处理外,其他各添加残渣处理的Chao1指数有不同程度降低;所有添加残渣处理的Shannon指数均有不同程度降低,但仅CL和PL处理在2.50%和10.00%添加水平下表现为显著降低(P<0.05);所有添加残渣处理的ACE和Simpson指数均无显著变化(P>0.05)。
表6 添加不同水平的3种农业副产物残渣对饲料桑青贮微生物Alpha多样性的影响

Table 6 Effects of adding different levels of three agricultural by-product residues on Alpha diversity of microbial community of mulberry silage

项目
Items		 添加水平
Addition
levels/%		 操作分类单元
OTUs		 Chao1指数
Chao1 index		 ACE指数
ACE index		 Shannon指数
Shannon
index		 Simpson指数
Simpson
index
饲料桑原料FM 141.00c 212.88c 218.17c 0.76c 0.24b
CK处理CK treatment 0 436.00ab 525.38ab 527.52ab 3.62a 0.94a
RC处理RC treatment 1.25 458.67ab 581.19a 585.81a 3.49ab 0.91a
2.50 317.67b 415.92ab 398.73abc 3.33ab 0.93a
5.00 342.67ab 443.83ab 437.69ab 3.29ab 0.92a
10.00 394.67ab 524.61ab 518.67ab 3.51ab 0.93a
CL处理CL treatment 1.25 339.00ab 411.14ab 415.82abc 3.49ab 0.93a
2.50 296.00b 354.18bc 358.19bc 3.16b 0.92a
5.00 322.00b 406.87ab 404.31abc 3.29ab 0.92a
10.00 348.00ab 456.48ab 447.45ab 3.16b 0.90a
PL处理PL treatment 1.25 286.33bc 353.99bc 353.35bc 3.23ab 0.92a
2.50 359.67ab 492.81ab 496.67ab 3.12b 0.91a
5.00 501.00a 567.41a 595.84a 3.24ab 0.91a
10.00 405.33ab 570.12a 588.39a 3.11b 0.91a
均值标准误SEM 71.873 81.524 86.313 0.166 0.006
P值P-value 0.008 0.005 0.006 <0.001 <0.001
添加不同水平的3种农业副产物残渣的饲料桑青贮微生物群落在门和属水平上的分布如图1所示。在门水平上,新鲜饲料桑原料的优势菌门为变形菌门(Pseudomonadota),青贮后优势菌门为变形菌门、厚壁菌门(Bacillota)和拟杆菌门(Bacteroidota);与CK处理相比,2.50%、5.00%和10.00%添加水平下的CL和PL处理的厚壁菌门相对丰度均增加(图1-A)。在属水平上,新鲜饲料桑原料的优势菌属主要为不动杆菌属(Acinetobacter);青贮后优势菌属由不动杆菌属转向肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、科萨克氏菌属(Kosakonia)、弧形单胞菌属(Vibrionimonas)、植物乳杆菌属(Lactiplantibacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)和乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)等菌属(图1-B)。
图1 添加不同水平的3种农业加工副产物残渣的饲料桑青贮微生物群落在门(A)和属(B)水平上的分布

FM表示饲料桑原料;CK表示对照处理;RC1、RC2、RC3、RC4分别表示1.25%、2.50%、5.00%、10.00%五倍子渣处理;CL1、CL2、CL3、CL4分别表示1.25%、2.50%、5.00%、10.00%刺梨渣处理;PL1、PL2、PL3、PL4分别表示1.25%、2.50%、5.00%、10.00%葛根渣处理。下图同。

Fig.1 Microbial community distribution at phylum (A) and genus (B) levels in forage mulberry silage adding different levels of three agricultural by-product residues

FM indicates forage mulberry raw material; CK indicates control treatment; RC1, RC2, RC3 and RC4 indicate 1.25%, 2.50%, 5.00% and 10.00% of Galla chinensis residue treatments, respectively; CL1, CL2, CL3 and CL4 indicate 1.25%, 2.50%, 5.00% and 10.00% of Rosa roxburghii residue treatments, respectively; PL1, PL2, PL3 and PL4 indicate 1.25%, 2.50%, 5.00% and 10.00% of Pueraria lobata root residue treatments, respectively. The same as below.

饲料桑青贮中前11种菌属在各处理中的相对丰度如图2所示。相比于新鲜饲料桑原料,各青贮处理的泛菌属和不动杆菌属相对丰度显著降低(P<0.05),另外9种菌属相对丰度均显著升高(P<0.05)。青贮60 d后,饲料桑青贮中主要以肠杆菌属和肠球菌属为主。相比于CK处理,1.25 %RC、1.25% CL和10.00% CL处理的植物乳杆菌属相对丰度显著升高(P<0.05);但2.50%、5.00%、10.00% CL和RC处理的魏斯氏菌属、伴生乳杆菌属、乳酪杆菌属相对丰度均有不同程度降低,10.00% PL处理的植物乳杆菌属、魏斯氏菌属、片球菌属相对丰度也有不同程度降低。
图2 饲料桑青贮中前11种菌属在各处理中的相对丰度

数据柱标注不同小写字母表示存在显著差异(P<0.05)。

Fig.2 Relative abundances of top 11 bacterial genera in forage mulberry silage of each treatment

Data columns with different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

LEfSe分析结果(图3)表明,不同类型的残渣具有不同的标志性差异微生物,显著影响饲料桑青贮的微生物群落[线性判别得分(LDA)>6.0]。CK处理无特征差异微生物,1.25% RC和1.25% CL处理特征差异微生物分别为毛螺菌目(Lachnospirales)和乳球菌属(Lactococcus),2.50% PL处理以伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)为显著富集类群,10.00% RC处理的优势类群主要为黏液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、拟杆菌目(Bacteroidales)和桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)。
图3 饲料桑青贮微生物群落差异分析

Fig.3 Differential analysis of microbial community in forage mulberry silage

在RC处理中:由图4-A可知,乳酪杆菌属和促生乳杆菌属相对丰度均与TF含量呈显著正相关(P<0.05);魏斯氏菌属相对丰度与CP含量呈显著负相关(P<0.05);其余优势菌属相对丰度与发酵品质指标和活性成分之间虽存在一定的相关关系,但均未达到显著水平(P>0.05)。青贮品质指标和活性成分间的相关性分析(图4-B)显示,LA与AA含量呈显著正相关(P<0.05);pH与PA含量呈显著正相关(P<0.05);NH3-N与CP含量呈显著负相关(P<0.05)。
图4 相关性分析与Mantel检验

A、C、E分别为RC、CL和PL处理中发酵品质指标和活性成分与主要菌属的相关性(·:P<0.05),B、D、F分别为RC、CL和PL处理中发酵品质指标和活性成分的相关性以及它们与3类微生物特征(群落结构、功能和OTUs特征)的关联(*:0.01≤P<0.05;**:0.001≤P<0.01;***:P<0.001)。

Fig.4 Correlation analysis and Mantel test

A, C and E show the correlations between fermentation quality parameters/active components and major bacterial genera in RC, CL and PL treatments, respectively (·: P<0.05). B, D and F show the correlations among fermentation quality parameters and active components and their associations with three microbial characteristics (community structure, community function and OTU features) in RC, CL and PL treatments, respectively (*: 0.01≤P<0.05; **: 0.001≤P<0.01; ***: P<0.001).

在CL处理中:由图4-C可知,魏斯氏菌属和肠球菌属相对丰度均与AA含量呈显著负相关(P<0.05),与PA含量呈显著正相关(P<0.05);弧形单胞菌属相对丰度与PA含量呈显著负相关(P<0.05),但与NH3-N含量呈显著正相关(P<0.05);此外,片球菌属相对丰度与TP含量呈显著负相关,而肠杆菌属相对丰度与TP含量呈显著正相关(P<0.05)。各青贮品质指标和活性成分间的相关性分析(图4-D)显示,AA与PA含量呈显著负相关(P<0.05);TF与AA含量呈显著正相关(P<0.05),但与PA和CP含量呈显著负相关(P<0.05)。Mantel检验(图4-D)显示,PA、TP和TF含量是显著驱动该处理微生物群落结构变化的关键环境因子;微生物群落功能受PA含量的显著影响(P<0.05);而青贮系统的OTUs特征主要受PA含量的显著影响(P<0.05)。
在PL处理中:由图4-E可知,泛菌属相对丰度与LA含量、乳酪杆菌属相对丰度与PA含量、植物乳杆菌属相对丰度与TP含量,以及弧形单胞菌属相对丰度与TF含量均呈显著正相关(P<0.05);片球菌属相对丰度与TF含量、植物乳杆菌属相对丰度与NH3-N含量,以及弧形单胞菌属相对丰度与LA含量呈显著负相关(P<0.05)。青贮品质指标和活性成分间的相关性分析(图4-F)显示,LA与AA含量呈显著正相关(P<0.05),且LA、AA含量均与PA和TF含量呈显著负相关(P<0.05)。Mantel检验(图4-F)显示,LA和TF含量是显著驱动该处理微生物群落结构变化的关键因子(P<0.05);TP含量对群落功能表现出显著影响(P<0.05);TF、NH3-N含量对青贮系统的OTUs特征表现出显著影响(P<0.05)。

3 讨论

3.1 添加不同水平的3种农业副产物残渣对饲料桑青贮营养成分和活性成分的影响

本研究中,除1.25%和2.50% PL处理外,其余添加残渣处理的DM含量均高于CK处理,这主要是由于添加的农业副产物残渣经过烘干处理后DM含量较高,从而提高了饲料桑青贮的DM含量。此外,添加3种农业副产物残渣还提高了饲料桑青贮的NDF含量,其中CL和PL处理整体高于CK处理,与金丽娜等[18]得出的黄芪药渣提高青贮全株玉米NDF含量的结果一致。这可能与这些农业副产物残渣本身具有较高的纤维含量[19]有关。CP含量是评估青贮品质的关键指标之一,饲草蛋白质流失会导致反刍动物氮素利用率下降[20]。与CK处理相比, RC处理饲料桑青贮的CP含量普遍升高,这一方面是由于五倍子渣CP含量较高(141 g/kg DM),会直接提升饲料桑青贮的CP含量;另一方面是由于五倍子中富含水解单宁(50%~70%),五倍子渣中残留的部分水解单宁与蛋白质发生络合反应,形成不易降解的复合物,降低了蛋白质被植物蛋白酶和微生物脱氨酶降解的程度,从而提高了CP的保存率[21]。
饲料桑富含黄酮类、生物碱、多糖等活性物质,具有抗氧化、抗炎和抗病毒等生物活性[22]。青贮发酵有助于保存饲草的营养成分和活性成分,本试验中,添加2.50%、5.00%和10.00%的刺梨渣提高了饲料桑青贮中TF和TP含量,且随着添加水平的升高而增加,这可能是由于刺梨渣本身TF和TP含量高于饲料桑和其他2种残渣。这些活性成分可作为潜在的抗生素替代品,有助于提高家畜的免疫力、抗氧化能力和生产性能[23]。综合来看,饲料桑青贮过程中添加农业副产物残渣所带来的营养效应,不仅取决于其自身的化学组成,还取决于其在青贮发酵过程中对营养成分和活性成分的保存能力。

3.2 添加不同水平的3种农业副产物残渣对饲料桑青贮发酵品质的影响

pH是反映青贮发酵过程中饲草缓冲能变化和有机酸积累的直接指标[24]。本试验中,各处理饲料桑青贮的pH均高于4.2;Zhao等[8]和Li等[7]也观察到添加刺梨渣的苜蓿青贮pH高于5.0的现象。这可能归因于:一方面,饲料桑和农业副产物中富含木质纤维素、蛋白质和矿物质,导致其具有较高的缓冲能值[11],中和了发酵产生的有机酸而延缓pH下降;另一方面,本研究中各处理饲料桑青贮的LA含量普遍偏低(19.83~32.46 g/kg DM),导致青贮体系酸化不足。但RC和CL处理的pH低于CK处理,pH介于4.3~4.4。这些处理pH的降低可能与这些农业副产物残渣中自带的酸性化合物,如抗坏血酸、柠檬酸、苹果酸等有机酸有关,使发酵基质呈酸性,这与Li等[25]的研究结果一致。本研究发现,CL处理虽然具有较高的WSC含量,但其pH和LA含量随刺梨渣添加水平的升高而降低,可能是因为刺梨渣中的黄酮和酚酸类化合物抑制了某些对环境敏感的乳酸菌的生长[26]。研究发现,外源接种乳酸菌可增加添加刺梨渣的苜蓿和高粱青贮中的乳酸菌数量和LA含量[8],后续研究在添加刺梨渣或其他农业副产物残渣时,可外源接种乳酸菌以进一步改善青贮产酸效果。另外,CL处理中随着残渣添加水平的升高,AA含量升高而PA含量降低,PL处理则呈相反趋势。其中,CL处理AA与TF含量呈显著正相关,该处理AA含量的升高可能是因为刺梨渣中较高的黄酮类化合物可作为信号物质,选择性富集肠杆菌属、科萨克氏菌属和弧形单胞菌属[27];肠杆菌属作为典型的混合酸发酵菌,通过厌氧发酵途径将碳水化合物转化为AA[28],导致CL处理中AA积累。相关性分析发现,PL处理中PA含量与乳酪杆菌属相对丰度呈显著正相关。据报道,乳酪杆菌属能将膳食脱氧己糖转化为1,2-丙二醇,随后被其他细菌转化为丙酸[29],PL处理中PA含量的增加可能与乳酪杆菌属相对丰度增加有关,因而添加葛根渣的饲料桑青贮可能具有更强的抗真菌能力。此外,所有处理中均未检测到BA,表明厌氧发酵体系中pH的降低抑制了产丁酸的梭菌的生长[5]。另外,5.00% RC处理外的各添加农业副产物残渣处理的NH3-N含量均显著低于CK处理,进一步表明青贮发酵过程中农业副产物残渣中的活性成分和pH的降低导致脱氨基细菌和植物蛋白酶的活性降低,抑制了蛋白质的降解。
V-score评价体系将AA、PA、BA和NH3-N含量都视为负向指标,其数值较低得分越高。CK处理的V-score最低,表明农业副产物残渣添加可以有效改善饲料桑青贮的发酵品质,并以添加10.00%五倍子渣、10.00%刺梨渣和2.50%葛根渣时效果较佳。其中,添加10.00% RC五倍子渣时营养品质表现最优,与V-score结果一致;但是刺梨渣添加量超过2.5%后,LA含量和肠球菌属、植物乳杆菌属、魏斯氏菌属、促生乳杆菌属、乳酪杆菌属、片球菌属相对丰度均降低,与V-score排名有一定差异,可能是因为该评价体系中没有包含LA含量,这也从另一方面说明高水平刺梨渣的添加不会导致饲料桑青贮发酵品质的劣变。

3.3 添加不同水平的3种农业副产物残渣对饲料桑青贮微生物群落结构的影响

Alpha多样性分析表明,与CK处理相比,反映微生物群落多样性的Shannon和Simpson指数在所有添加残渣处理中均有所降低;而反映微生物群落丰富度的Chao1和ACE指数,除1.25% RC处理及5.00%、10.00% PL处理外的其他添加农业副产物残渣处理中也呈下降趋势,这与在苜蓿青贮中添加中药渣所得结果[30]相一致。已有研究表明,五倍子中的没食子酸和没食子酸甲酯[31]以及刺梨中的异牡荆素[4]等活性成分对多种植物病原体和肠道微生物具有抑制作用。本研究中微生物多样性和丰富度的降低,暗示这些农业副产物残渣中的活性成分对青贮微生物群落的潜在抑制作用;同时,多数处理中特有OTUs数量的减少,结合Alpha多样性指数的下降,表明这些农业副产物残渣对特定微生物类群具有选择性抑制效应,致使细菌群落结构趋于简化。
在门水平上,青贮发酵的典型演替规律是变形菌门被厚壁菌门取代。本研究中,尽管各处理的厚壁菌门在青贮后相对丰度升高,但变形菌门仍在多数处理中占据主导地位,未被完全抑制。已有研究表明,植物根系分泌的黄酮类化合物(如芹菜素和木犀草素等)可定向富集在变形菌门中的草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)和假单胞菌属(Pseudomonas),提高这类细菌在根系中的定植[27,32]。据此推测,饲料桑或这3种农业副产物残渣中富含的黄酮类化合物可能选择性富集在变形菌门下的肠杆菌属、科萨克氏菌属和弧单胞菌属,使其能够在酸性条件下存活并维持一定丰度。然而,黄酮类化合物在厌氧发酵体系中对变形菌门细菌的具体互作机制仍需进一步研究。
微生物群落的演替对青贮品质具有决定性影响。青贮发酵初期,魏斯氏菌属和肠球菌属等附生细菌通常占据优势,随发酵的进行逐步被耐酸性更强的乳酸菌所取代[33]。本试验中,青贮60 d后,所有RC处理、1.25%和10.00% CL处理以及2.50%PL处理中植物乳杆菌属相对丰度显著高于CK处理,但其最大相对丰度仅达20%左右。这可能是由于饲料桑表面初始附生的乳酸菌数量较低[24],同时农业副产物残渣中高浓度的黄酮类化合物和有机酸可能对乳酸菌的生长产生了抑制或延迟作用[7],无法快速降低肠杆菌属等高丰度杂菌对发酵底物的竞争性消耗,导致乳酸菌生长受抑、发酵进程缓慢。此外,不同的农业副产物残渣选择性地富集了特定的细菌类群,毛螺菌目与RC处理密切相关,而乳球菌属则在CL处理中富集,表明含有不同活性成分的农业副产物残渣在青贮期间对微生物群落具有差异化的调节作用。

3.4 添加不同农业副产物残渣的饲料桑青贮过程中的环境驱动因子以及各指标间的相关性

青贮发酵是一个由微生物主导、多种代谢产物共同协调的复杂微生态演替过程。本研究的Mantel检验结果表明,不同处理中驱动微生物群落结构和功能演替的关键环境因子存在差异。CL处理中,PA、TP和TF含量发挥核心调控作用,是主要的环境驱动因子;PL处理中,LA和TF含量是主要的环境驱动因子;RC处理中,并未表现出单一主导的环境驱动因子。上述结果表明,不同的农业副产物残渣处理改变了饲料桑青贮的微环境,有机酸、活性成分含量这些环境因子可对微生物群落进行筛选,导致青贮系统中微生物群落构成和功能的显著分化。
相关性分析发现,RC处理中CP与NH3-N含量呈显著负相关,可能是因为五倍子渣中的水解单宁可与蛋白质结合,减少脱氨作用对蛋白质的降解[18]。CL处理中弧形单胞菌属相对丰度与NH3-N含量呈显著正相关,表明此类菌群可能参与了该处理中蛋白质降解或氨基酸代谢过程。有机酸的积累和pH的下降是青贮成功的关键,PL处理中泛菌属相对丰度与LA含量、乳酪杆菌属相对丰度与PA含量均呈显著正相关。乳酪杆菌属细菌作为兼性异型发酵乳酸菌,不仅能产生乳酸,在特定条件下还能代谢产生AA和PA[33]。CL处理中魏斯氏菌属和肠球菌属相对丰度与AA含量呈显著负相关,与PA含量呈显著正相关。魏斯氏菌通常在青贮发酵初期活跃,随着发酵体系中AA等有机酸的大量积累,环境pH迅速下降,超出其耐受范围,从而导致其相对丰度降低。
Mantel检验结果表明,TF含量是驱动CL和PL处理中微生物群落结构变异的关键因子。PL处理中TF含量与片球菌属相对丰度呈显著负相关,但与弧形单胞菌属相对丰度呈显著正相关;而RC处理中,TF含量的增加促进了乳酪杆菌属和促生乳杆菌属的富集。这种差异性调控作用可能归因于黄酮类化合物的抑菌广谱性及其与不同细菌细胞膜结构的特异性结合能力[34]。黄酮类化合物可抑制敏感菌群的生长,同时保留耐受性较强的乳酸菌(如乳酪杆菌属),从而重塑青贮微生物群落的组成与功能。此外,相关性分析表明,TF含量与AA、PA含量呈显著负相关,暗示高浓度TF积累可能通过调控碳水化合物代谢途径,进而影响有机酸的生成类型。

4 结论

3种农业副产物残渣的添加改变了饲料桑青贮的营养成分、发酵品质与微生物群落结构。其中,添加五倍子渣能够有效维持较好的发酵品质并提升CP含量,其适宜添加水平可达10.00%;添加刺梨渣虽可提升WSC和TF含量,但高添加水平下会导致LA含量和乳酸菌相对丰度的下降,其添加水平不宜超过2.50%;而添加葛根渣则会提升PA含量。因此,富含活性成分的农业副产物残渣具有开发为新型功能性青贮添加剂的潜力,实际应用中需根据残渣类型严格控制添加水平。

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